Arranjar em seqüência de Maxam Gilbert

Como o ADN é arranjado em seqüência

ADN que arranja em seqüência usando o método de Maxam-Gilbert

Maxam-Gilbert que arranja em seqüência com este método do ADN que arranja em seqüência em vez de sintetizar o ADN in vitro e de parar as reações da síntese com terminais chain, este método começa com completo, termina o ADN etiquetado e fende-o com os reagentes específicos baixos. Assim como este método trabalha com bases da guanina, mas o mesmo princípio aplica-se a todas as quatro bases; Primeiramente nós extremidade-etiquetamos um fragmento que do ADN nós queremos arranjar em seqüência.

Este pode ser 5 ' - ou 3 ' - termina a rotulagem. Em seguida, nós modificamos um tipo da base. Aqui nós usamos o sulfato dimethyl (DMS) para misturar guaninas. (Realmente, este reagente igualmente mistura adenines, mas não em uma maneira aquele conduz à segmentação da costa do ADN.) Como no método chain da terminação, nós não queremos afetar cada guanina, ou nós produziremos somente os fragmentos minúsculos que não permitirão que nós determinem a seqüência do ADN. Conseqüentemente, nós fazemos o methylation sob as circunstâncias suaves que conduzem a uma média de somente uma guanina misturada por a costa do ADN. Em seguida, nós usamos um reagente (piperidine) que faça duas coisas: causa a perda da base misturada, a seguir quebra a espinha dorsal do ADN no local da base perdida (o local apurinic). Neste caso, o G no meio da seqüência foi misturado, assim que a ruptura da costa ocorreu lá, produzindo um trimer etiquetado.

Em uma outra molécula do ADN, o primeiro G não poderia ser misturado, causando um fosfato etiquetado (a base e o açúcar seriam perdidos nas segmentações químicas). Finalmente, nós electrophorese os produtos e detectamo-los pela autoradiografia, apenas como no método da corrente-terminação. Naturalmente, nós precisamos de funcionar outras três reações que se fendem em outras três bases. Há diversas maneiras de fazer isto. Por exemplo, nós podemos enfraquecer as ligações do heterósido à adenina e à guanina com ácido; então o piperidine causará a depuração e a ruptura da costa após ambos como e o Gs. Se nós electrophorese isto reação de A + de G ao lado da reação de G somente, nós podemos obter como pela comparação. Similarmente, a hidrazina abre anéis do thymine e do cytosine, e o piperidine pode então remover estas bases e quebrar a costa do ADN nos locais resultantes do apyrumidine. Na presença do NaCl de 1M, a hidrazina é específica para o cytosine somente, assim que nós podemos funcionar esta reação ao lado da reação de C+T e obter os Ts pela comparação.