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Cultura Bacteriana Dos Media Nutrientes

Informação no crescimento de culturas bacterianas usando caldos de carne dos media e placas nutrientes da cultura

Índice:

Tópicos bacterianos da pesquisa de defeitos e do forum da cultura

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Que é definição nutriente dos media?

"quimicamente, como todas pilhas vivas restantes, os microorganisms consistem no nitrogênio orgânico e inorgánico e em sais minerais; é conseqüentemente necessário a fim crescer um microorganism, esse estas três classes das substâncias seja feito disponível, junto com o oxigênio, que é um essencial à vida de todas as estruturas vivas. Finalmente uma determinada quantidade de umidade é absolutamente necessária." (Besson.)

Um alimento preparou-se para o crescimento dos microorganisms é dado o media geral do nutriente do termo. Um grande número microorganisms crescerão prontamente ou em cima de media nutrientes fàcilmente disponíveis, como o leite, o caldo de carne, etc.. Alguns isms microorgan têm exigências extensamente diferindo do alimento e necessitam-nas para os media nutrientes do crescimento que diferem extensamente em sua composição.

Entretanto, há algumas réguas gerais que devem ser aplicadas na preparação de todos os media nutrientes para o uso dos microorganisms. Estes são momentaneamente, isso:

Cada media de cultura deve

1. Contenha as substâncias necessárias para o crescimento.
2. Seja da reação apropriada.
3. Seja contido nas embarcações que têm recursos para a proteção da contaminação das fontes exteriores.

Classificação de media nutrientes

Os media de cultura podem ser classificados como:

I. Media naturais como ocorrendo na natureza, por exemplo, leite, batata e os outros vegetais, carne e produtos de carne, sangue e serum de sangue, ovo, solo, etc..

II. Media preparados, isto é, feitos no laboratório. Estes são:

(a) De composição química desconhecida; por exemplo, ágar, gelatin, etc. nutrientes.

(6) synthetic; isto é, composição química sabida, por exemplo, solução de Giltay para organismos denitrifying.

Ou como:

I. Media Líquidos. Estes incluem:

A. Media feitos do tecido animal e dos líquidos, por exemplo, caldo de carne nutriente, caldo de carne do serum, caldos de carne do hidrato de carbono, leite, sangue, solução, solução do peptone do nitrate de Dunham.

B. Media feitos do tecido vegetal. Entre estes seja: Extrato de malt (cevada germinated), wort da cerveja, extrato de fermento, infusion do feno, sucos de fruta naturais, vinhos (sucos de fruta fermented).

C. Media sintéticos.

II. Media Contínuos. Este o mav seja classificado como:

A. Liquefiable, por exemplo, ágar nutriente, gelatin nutriente.

B. Non-non-liquefiable, incluindo: 1. Os media líquidos em um estado natural mas que, uma vez que solidified, não pudesse liquefied por meios físicos, por exemplo, media preparados dos líquidos albuminous e tecidos tais como o ovo, o serum de sangue, etc., ou os media sintéticos solidified com silicato do sodium.

2. Media que são contínuos no estado natural, por exemplo, media vegetais tais como a batata, a cenoura, a banana, etc..

 

 

EXERCÍCIO 3. TITRATION DOS MEDIA

O titration dos media bacteriological feitos da carne é uma etapa importante em sua preparação, porque os microorganisms são sensíveis à reação da carcaça nutriente.

Procedimento. O seguinte método é usado para media do laboratório, à excecpção do leite, do wort, da cidra, do vinagre, dos sucos de fruta, etc.. Veja p. 22.

1. Ponha 5 c.c. do media a ser testados e de 45 c.c. da água destilada em um prato evaporando.

2. Fervura vivamente um minuto com agitar da constante (para dirigir fora de todo o CO2 dissolvido que regista como o acidity).

$. adicionam 1 solução do phenolphthalein de c.c. para o indicador.

4. Titrate quando quente, preferivelmente ao ferver, com hydroxide do sodium N/20, ou ácido N/20 hydrochloric como o caso de mands. ' um fraco mas a cor cor-de-rosa do permanent distinto marca o ponto de extremidade. Esta cor deve remanescer permanente por cinco minutos.

5. Compute e grave a reação do media nos graus de uma escala mais cheia, que seja o número de medidores cúbicos do centi do normal * ácido ou alcalóide atual em 1000 cúbicos

* Uma solução está dita ser normal quando contem um alent equivalente de 1 grama de um ácido ou de uma base em 1 litro.

Um equivalente do grama de um ácido ou de uma base é essa quantidade a que é equivalente ou neutralizará a molécula de 1 grama de um ácido mono-basic ou de uma base do mon-ácido.

A vantagem do sistema é esse 1 c.c. de todo o normal a solução exatamente neutralizará ou será exatamente equivalente a 1 equiva do milligram emprestado de qualquer ácido ou base. (Noyes, Wm. A., textbook de Chemistry, 1913, p. 184.)

TITRATION DOS MEDIA 21

centimeters do médio, usando o phenolphthalein como o cator do indi.

6. Os media alcalinos são denotados colocando a menos () o sinal antes do número dos graus de alkalinity; assim, 15 indicariam que o media era 15 alcalinos, ou que o ácido normal de 15 c.c. deve ser adicionado por o litro ao ize neutro ele.

Os media ácidos são denotados colocando a mais (+) o sinal antes do número dos graus de acidity; assim, +15 indicariam que o media era 15 ácidos ou que 15 c.c. do alcalóide normal deve ser adicionado por o litro ao neu tralize o.

Exemplo.

Leitura da bureta após titrating 5.4 c.c.

Leitura da bureta antes de titrating 2.0 c.c.

Número do NaOH de c.c. N/20 requerido

para neutralizar o ácido em 5 c.c. de

o 4 médio c.c.

Se 5 c.c. do médio (que é 1/20 de 100 c.c.) reque

3. 4 c.c. de 1/20 de NaOH normal para neutralizar os pres ácidos ent, 100 c.c. do media requereria 20X3.4 c.c. ou 68 c.c. de 1/20 de NaOH normal.

Porque uma solução normal é 20 vezes a força de uma solução do normal de 1/20, 100 c.c. do media requereria 1/20 de 68 c.c. ou 3.4 c.c. do NaOH normal para a neutralização; e um litro ou 1000 c.c. do media requereria 10X3.4

c. c. ou 34 c.c. NaOH de N/l para a neutralização; isto é, o media é o ácido 34. Escala mais cheia. Este é o litro do media.

Quando ácido N/20 ou alcalóide e uma parcela de 5 c.c. do media (em 45 c.c. da água destilada) são usados, cada 1/10 de 1 c.c. corresponde a 1 escala mais cheia.

Ajuste da reação. Se se desejar deixar o media com o a, por exemplo, reação +15, nós temos:

22 GENERAL MICROBIOLOGY

Acidity do media

(+34) 3.4 c.c. por 100 c.c. do media

Acidity desejado (+15). . 1.5 c.c. por 100 c.c. da quantidade média de alcalóide normal

para ser adicionado 1.9 c.c. por 100 c.c. do media

ou 10X1.9 c.c. = 19 c.c. NaOH de N/l por 1000 c.c. do media

Desde que as soluções normais são da força igual pelo volume, isto é, 1 c.c. de N/l o ácido neutralizará apenas 1 c.c. do alcalóide de N/l, prontamente ver-se-á que se 15 c.c. O NaOH de N/l é requerido para neutralizar o ácido atual em 1 litro do media, a seguir deve haver atual nesse litro exatamente 15 c.c. do ácido de N/l, ou de nós deve dizer que a reação tem (+ 15) quinze graus ácida. Para qualquer outro grau de acidity adicione bastante alcalóide normal para reduzir o acidity ao ponto desejado.

A reação de um media muda um tanto após sua neutralização, especial durante a esterilização, mas também em cima de estar mais tarde na temperatura ordinária. Esta mudança é para um acidity aumentado, e é a mais marcada nos media ricos no dextrose. Conseqüentemente é necessário determinar o titre de um media então é usada melhor que para citar as figuras obtidas antes da esterilização.

LEITE, CIDRA, VINAGRE, WORT, E SUCOS DE FRUTA

Procedimento. 1. Em uma medida 5 c.c do prato evaporando. do media a ser testado, por meio da pipeta apropriada. Faça até 50 c.c. com água destilada.

Não aqueça. Os media acima não devem ser aquecidos antes do titration, enquanto contêm os ácidos temporários ou outras substâncias orgânicas que podem registar como o ácido e que podem ser dirigidos fora fervendo,

2. Adicione 1 solução do phenolphthalein de c.c..

3. Adicione, gradualmente, de uma bureta exata, NaOH IN/20 até que a primeira cor-de-rosa permanente apareça.

4. Anote a quantidade de NaOH requerida para o titration.

5. Funcione sempre duplicatas.

LEITE 23

6. Registro como graus de acidity o número de c.c. do NaOH de N/l que seria requerido para neutralizar um litro do media.

LEITE

O leite é valioso como um media nutriente para microorganisms porque: É um nutriment natural e quase ideal para um grande número microorganisms. Seus composição, casein 3.40%, 3.50% gordura do ing do averag e albumen, 4.50% açúcares de leite, 0.75% cinza, 87.75% molham, são uma evidência que equipa o alimento em um formulário excelente para a maioria de microorganisms.

As atividades biochemical de muitas bactérias revelam-nas selves definitivamente nas mudanças que ordenham, especial leite do litmus, submetem-se. Muitas destas mudanças são macro visto scopically. Alguma destes é:

(a) Produção Ácida. O lactose, C^IfeOn (açúcar de leite), é invertido primeiramente, dando forma a duas moléculas do hexose, 1 mol. Dextrose e 1 mol. Galactose.

E cada molécula de rendimentos do hexose duas moléculas do ácido lactic:

hexose = ácido lactic.

C 6 H 12 6 = 2CH 3 CH(OH)COOH.

O litmus azul é girado vermelho.

(b) Produção Do Alcalóide. O litmus transforma-se um azul mais escuro. Esta mudança acompanha muito frequentemente o peptonization.

(c) Redução (decolorization do litmus). Isto é devido à redução da matéria da coloração (litmus). Muitos microorganisms secrete os enzymes que produzem o hidrogênio. O hidrogênio combina com o litmus, reduzindo o ao seu leuco-composto (incolor). (o azul de Methylen se transforma cor mais menos abaixo como circunstâncias.) Que esta é uma redução e não uma destruição pode ser demonstrado agitando a cultura descolorizada com alguns centimeters cúbicos do peroxid hydro do gen. As bactérias que descolorizam o litmus também

24 GENERAIS MICROBIOLOGY

reduza o peroxid do hidrogênio a E^O e ao oxigênio nascent que reoxidizes o litmus reduzido (que mostra pelo tion do reac do leite o tipo de microorganisms atuais). A oxidação re ocorre lentamente sob circunstâncias naturais. A redução pode ocorrer quando o leite é ácido, alcalino ou neutro.

(d) Curdling com a produção ácida. O casein, como a maioria de proteínas, é amphoteric, isto é, é capaz de reagir ambos como um ácido fraco e uma base fraca. O casein de outra maneira insoluble é encontrado para estar no leite em um estado parcialmente dissolvido (colloidal), devido a sua combinação com os sais do cálcio: o cálcio que foi combinado anteriormente com o casein, com a produção do ácido por determinados micro organismos, combina agora com o ácido lactic; em conseqüência os precipitates do casein, causando curdling (coagulation). O mus do lit é vermelho decidedly girado. O leite que come uma coalhada ácida titrate acima de +50.

(e) Coalhada Do Rennet. O coagulation pode também ocorrer quando o media é neutro ou somente ácido do slightly^. Este duction pro da coalhada é devido a a rennet-como o enzyme produzido por microorganisms, e é similar à ação do rennet usado curdle o leite em fábricas de queijo.

Muitas espécies spore-forming são encontradas sob o grupo de organismos rennet-produzindo. A coalhada do rennet é seguida geralmente pelo peptonization.

(/) Peptonization. A coalhada produzida pelo ácido ou ren rede-dando forma a microorganisms pode gradualmente desaparecer, o ing somente a do leav whey-como o líquido. Isto é causado por determinadas bactérias que produzem os enzymes proteolytic que digerem a coalhada e a rendem soluble. Este liquefaction de teins pro contínuos gosta do gelatin, do fibrin, do branco fervido do ovo, da coalhada de leite, etc., é devido a dois grupos dos enzymes, do pepsin e do trypsin.

O pepsin do corpo animal age somente em um media ácido (presente no estômago).

O trypsin do corpo animal age somente no media alcalino (presente no intestine).

PREPARAÇÃO DO LEITE 25 DO LITMUS

O pepsinand trypsin-como os enzymes produzidos por micro organismos não pode assim ser separado por sua atividade em um media de determinada reação; isto varia com a espécie do microorganism e com circunstâncias ambientais. O tonization do pep do leite ocorre geralmente em um ponto morto, ligeiramente alcalino, ou mais infrequëntemente na reação ligeiramente ácida.

Alguns organismos peptonize o leite sem dar forma a uma coalhada do rennet.

(g) Produção Do Gás. Isto é caracterizado pelo para o mation de bolhas do gás no leite, e é geralmente accom panied pela formação da coalhada ácida. Muito geralmente a coalhada encolhe, causando a extrusão do whey.

EXERCÍCIO 4. PREPARAÇÃO DO LEITE DO LITMUS

Instrumento. Leite separado ou skimmed fresco; instrumento do tion do titra; NaOH N/20; phenolphthalein (indicador); pipeta de 5 c.c.; azolitmin, solução de 2%; funil de enchimento; torneira do pinch; tubos de teste sterile; instrumento para o zation do sterili do vapor.

Método. 1. O leite separado ou skimmed fresco deve ser usado. O leite inteiro é indesejável no cliente de seu índice gordo.

2. Titrate e grave a reação do leite. Se o leite titrates acima do ácido 17, a reação deve ser ajustada a +15. sour, curdled ou uncurdled o leite, após o zation do neutrali, não faz um media nutriente desejável para microorganisms, conseqüentemente, o leite cujo o titre está acima do ácido 20-25 deve ser rejeitado.

O leite fresco varia no acidity de 12 a 18. O leite com um acidity acima de 18 ao phenolphthalein não dará uma cor azul satisfatória com azolitmin, como em 18 começa a mostrar o coloration ácido.

3. Adicione 2% de uma solução padrão do litmin azo de Kahlbaum. O litmus ou o azolitmin são adicionados meramente como um cator do indi e devem ser da força suficiente de modo a para não diluir o leite a toda a extensão.

26 GENERAL MICROBIOLOGY

4. Misture o leite e o azolitmin completamente e tubo, usando aproximadamente 8 c.c. do litmus ordenhe em cada tubo.

Anote. Cuidado deve ser tomado para impedir o leite venha no contato com o alto dos tubos, porque fará com que as fibras do algodão adiram ao tubo. Isto pode ser evitado pelo uso "de um funil de enchimento."

5, sterilize aquecendo-se no vapor fluindo por vinte minutos em quatro dias sucessivos. O leite é difícil de sterilize, devido aos spores resistentes que estão freqüentemente atuais. Se se desejar sterilize um volume maior do que nos tubos, a época do heating deve ser alongada.

Cuidado: Superaquecer tende a mudar (caramelize) o açúcar de leite. A cor do azolitmin pode também ser destruída. Estas mudanças não são desejáveis.

EXERCÍCIO 5. PREPARAÇÃO DA BATATA DO GLYCERIN

Um número de organismos chromogenic e pathogenic prosperam especial bem nos media que contêm o glycerin. A maneira em que o glycerin favorece o crescimento destes isms do órgão não é sabida, mas em alguns exemplos que parece ser utilizado diretamente para a construção da gordura (losis de Bact. Tubercu).

Instrumento. Batatas saudáveis grandes; faca cilíndrica da batata, ou perfurador da cortiça; faca ordinária; tumbler; bonate do carro do sodium, 1: solução 1000; glycerin, solução de 5%; tubos de teste sterile grandes, ou de batata dos roux tubos; algodão absorvente ou haste de vidro curta; 1 pipeta de c.c.; água destilada; instrumento para a esterilização do vapor.

Método. 1. Limpe com cuidado uma ou dois batatas grandes.

2. Por meio de uma faca da batata ou de um perfurador cilíndrico da cortiça, cilindros cortados da batata, 4 a 6 cm. Long e 1.5 a 1.8 cm. No diâmetro. Com uma faca ordinária, halve cada cilindro por um corte diagonal de modo que cada parte se assemelhe na forma a uma inclinação de ágar. Remova todas as parcelas da pele nestas partes.

3. Coloque em um tumbler e embeba em um diluído (1: 1000) solução do carbonato de sodium * por twenty-four horas somente.

* O carbonato de sodium é usado neutralizar os ácidos naturais da batata.

PREPARAÇÃO DA BATATA DO GLYCERIN

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4. Não transfira as partes a uma solução de 5% do glycerin na água para umas twenty-four horas mais adicionais somente.

5. Coloque nos tubos sterile preparados como segue: Selecione os tubos de teste grandes extra 1.5 a 2 cm. No diâmetro e limpo e seco eles. Coloque uma parte pequena de haste do algodão absorvente ou do vidro 0.5 cm. X2.5 cm. No fundo de cada um. Plug com algodão e sterilize na maneira usual. (os tubos dos roux necessitam ser limpados e sterilized somente.)

Imediatamente antes de introduzir as partes de batata, adicione aproximadamente 1 c.c. da água destilada a cada tubo, usando um pette do pi. A batata não deve tocar na água.

6. Sterilize aquecendo-se em 100 G. em quatro sucessivos

dias por vinte minutos cada dia.

Fig. 8. Tubos Da Batata. (Orig. Northrup.)

Cuidado: O tempo indicado em 3 e em 4 deve estritamente ser aderido a, mais as batatas terá que ser rejeitado no cliente do tion do contamina com organismos spore-forming resistentes.

REFERÊNCIA

SMIRNOW, M. R.: O valor de glycerinated a batata como um media de cultura. Centavo. F. Bakt., II Abt., Bd. 41, p. 303.

28 GENERAL MICROBIOLOGY

EXERCÍCIO 6. PREPARAÇÃO DO INFUSION DA CARNE

O infusion da carne é a fundação dos media nutrientes ordinários, como o caldo de carne, o gelatin e o ágar, e também de um grande número media nutrientes especiais, como caldos de carne do açúcar, etc..

Sob estes sentidos o infusion suficiente da carne pared pre para fazer 1 litro cada do caldo de carne, do gelatin e do ágar nutrientes.

Instrumento. 1.5 quilograma (3 Ibs.) Carne magra fresca finamente chopped; água da torneira de 1500 c.c.; balde do agateware de 3.5 litros; funil grande; carrinho do anel; limpe o pano; copo de medição de 1 litro; três flasks de 1 erlenmeyer sterile do litro; refrigerador; instrumento para a esterilização do vapor (autoclav preferível).

Método. 1. A 1.5 quilograma da carne magra finamente chopped, fresca em um balde do agateware de 3.5 litros, adicione 1500 c.c. da água da torneira, * não misture completamente e permita para estar em um lugar fresco (refrigerador preferido) por dezesseis a twenty-four horas somente.

2. Ajuste acima um funil grande em um carrinho do anel e coloque uma parte de pano limpo no funil. Coloque um copo de medição sob o funil.

3. Estique o infusion da carne através do cheesecloth limpo, extraindo completamente todo o suco. 1.5 litro deve ser recuperado. Se alguma perda ocorrer faça até 1500 c.c., usando a água da torneira.

Este líquido sanguineous resultante contem as albuminas soluble da carne, dos sais soluble, dos extractives e da matéria colorindo, principalmente hemoglobin.

4. Coloque 500 c.c. do infusion da carne em cada um de três flasks de 1 erlenmeyer sterile do litro. Substitua os plugues, e aqueça-os no autoclav em 120 C. por trinta minutos. Este é um procedimento mais seguro do que o heating por um tempo mais longo no vapor fluindo.

Durante este heating as albuminas coagulable pelo calor precipitated.

_ t est encontr necessário e também mais conveniente para prepar e sterilize carne infusion antes prosig com preparação diferente media que est us,

* Aproximadamente 500 c.c. da água a cada libra da carne.

PREPARAÇÃO DO CALDO DE CARNE NUTRIENTE 29

no cliente dos organismos spore-forming resistentes que estão quase universal atuais na carne chopped; a economia do tempo é também uma consideração. A menos que sterilized o immedi ately, infusion da carne decomposes rapidamente devido à abundância e à diversidade do microflora adquirido durante os vários processos da preparação para o mercado.

O infusion feito da carne magra recentemente chopped variará em um acidity entre uma escala +15 e +25 mais cheia. Se a reação for marcada mais baixa ou mais elevada, a ação microbial está ocorrendo, que é, ou pode ser, injurious ao valor de alimento do media em que o infusion da carne é usado.

O infusion contem a matéria albuminous muito pequena e consiste principalmente nos sais soluble do músculo, dos determinados extractives, e das matérias colorindo alteradas junto com os traços ligeiros da proteína coagulated pelo calor.

EXERCÍCIO 7. PREPARAÇÃO DO CALDO DE CARNE NUTRIENTE

O caldo de carne nutriente é o líquido padrão empregado para microorganisms tivating do cul. É praticamente um peptone taining con do chá de carne. O peptone, uma proteína soluble nao coagulable pelo calor, é adicionado para substituir as substâncias albuminous coagulated que precipitate quando o infusion da carne sterilized. O sal é adicionado para fazer exame do lugar dos phosphates e dos carbonatos, alguns de que precipitated em ajustar o acidity do media pelo hydroxide do sodium.

A reação de media nutrientes ordinários é ajustada a aproximadamente +15 com phenolphthalein como o indicador, porque se encontra que a maioria de microorganisms crescem melhor em um neutro médio ou ligeiramente alcalino ao litmus.

Quando se requer que os media nutrientes estejam desobstruídos, o albumen do ovo reduzido a uma pasta lisa com água (ou o branco batido poço de um ovo) são adicionados. Pelo coagulation, o albumen do ovo remove mecanicamente todas as partículas pequenas suspen dentro o sion que de outra maneira passaria através do papel de filtro.

30 GENERAL MICROBIOLOGY

Este processo for o mais eficiente quando os lates do coagu do albumen do ovo lentamente.

Porque o albumen do ovo começa a coagulate em aproximadamente 57 C. é absolutamente imperativo para os resultados do bom que o médio seja refrigerado a 40-50 C. antes da adição do albumen do ovo.

Embora o albumen do ovo contenha quantidades pequenas de matéria uble do solenóide nao coagulable pelo calor, como o açúcar, pelos extractives e a matéria mineral, que servirá como o alimento microbial, sua finalidade em media nutrientes é primeiramente para sua ação fying do clari.

Instrumento. infusion sterile da carne de 500 c.c.; água da torneira de 500 c.c.; 10 gms. Peptone, Witte; 5 gms. Sal; 10 gms. Albumen do ovo (ou um ovo); balde de 3.5 ágata-agate-ware do litro; instrumento do titration; NaOH N/20; NaOH De N/l; phenolphthalein (indicador); água destilada; pipeta de 5 c.c.; haste agitando grande; contrapesos grosseiros; queimador de gás grande; funil grande; papel de filtro plaited; funil de enchimento; tubos de teste sterile; flask sterile de 1 litro; instrumento para a esterilização do vapor -.

Método. 1. Ponha os índices de um flask do infusion da carne (500 c.c.) em um balde da ágata e adicione 500 c.c. da água da torneira.

2. Adicione 1% do peptone de Witte e 0.5% do sal.

3. Adicione 10 gms. Do albumen do ovo que foi misturado bem com os 100 c.c. da água da torneira. (posto o albumen do ovo em um tumbler e adicione bastante água para dar forma a uma pasta. Agite até que liso. Adicione então a água restante. Um ovo * bom batido pode ser substituído.) Misture tudo completamente.

4. Calor no vapor fluindo por minutos forty-five ou no autoclav em 120 C. por trinta minutos.

5. Titrate com NaOH N/20.

6. Ajuste a reação do media a +15 com NaOH normal ou o HC1 normal. Retitrate e ajusta outra vez se necessário.

7. O counterpoise e anota o peso.

8. Ferva quinze minutos sobre uma flama livre, agitando con stantly.

* Não é necessário adicionar a água ao ovo.

GELATIN 31

9. Counterpoise e restaure toda a perda pela evaporação com água destilada.

10. Filtre quando o papel de filtro plaited direto quente fervendo apenas se lavou previamente com litro de 1/2 da água fervendo.

11. Passe o filtrate através do mesmo papel até que está brilhante e desobstruído.

12. Encha trinta tubos de teste sterile, usando aproximadamente 8 c.c. deste media para cada tubo. Ponha o caldo de carne restante em um flask grande, sterile.

13. Aqueça os tubos e os índices de teste no vapor fluindo vinte minutos em três dias sucessivos.

14. Para sterilize um flask grande do caldo de carne, aqueça por vinte minutos quatro dias na sucessão.

GELATIN

O gelatin é uma das ferramentas do microbiologist. Como esta', serve a duas finalidades: como um media de cultura contínuo, um dispositivo técnico por que a isolação de uma única espécie do microorganism é feita possível, e, 2 aqueles organismos que secrete enzymes proteolytic, ela serve como um material nitrogenous do alimento.

O gelatin carrega a distinção de ser a primeira substância usada para um media de cultura contínuo. Este media era origi nated em 1882 por Robert Koch e tem desde revolutionized a ciência do microbiology. Antes da introdução de media contínuos, a isolação de uma única espécie do microorganism envolveu muita dificuldade e quase sempre uma determinada medida da incerteza. Para citar de Jordão: "não pode ser uma mera coincidência que as descobertas grandes no bacteriology seguiram rapidamente nos saltos desta melhoria técnica importante, e é talvez não demasiado para reivindicar que a ascensão do bacteriology do congeries de incompleto embora as observações importantes na posição de uma ciência biológica moderna devam ser dated aproximadamente deste período (1882)."

As primeiras placas de Koch foram feitas pelo derramando liquefied

32 GENERAL MICROBIOLOGY

gelatin nutriente em cima das partes sterile, lisas de vidro. O estudante em tornar-se familiar com as dificuldades pre de paring placas satisfatórias com o uso de "do prato petri" apreciará aqueles encontrados com com placas do gelatin de Koch nas primeiras.

O gelatin é uma proteína, isto é, um material nitrogenous do alimento. Contem enquanto seus elementos essenciais carbono, hidrogênio, oxigênio, e nitrogênio (outros elementos, entretanto, como o enxôfre, o phosphorus, etc., podem estar atuais). Sua fórmula empírica de acordo com Schiitzenberger e bourgeois é C7eHi24N24O29, mas tal fórmula dá somente a informação dos constituents principais e permite que um dê forma a alguma idéia do tamanho enorme da molécula; nenhuma idéia da estrutura da molécula é dada. Entretanto, digerindo com ácido sulfúrico diluído, o gelatin quebra para baixo na mesma maneira que as proteínas, rendendo o glycin, o leucin e outros amino-acids fatty.

O gelatin é uma proteína animal, mas faz quente ocorre como o gelatin nos tecidos animais. Existe lá como o collagen do minoid do albu que é o constituent contínuo principal do tecido conexivo fibrous, sendo encontrado também, mas na porcentagem menor, no cartilage, no osso e no ligament. O collagen destas várias fontes não é idêntico na composição e o gelatin varia correspondingly, por exemplo, o gelatin do cartilage difere daquele de outras fontes que contem uma porcentagem mais baixa do nitrogênio.

O gelatin, o corpo resultando do hydrolysis do collagen, é também um albuminoid. (Hofmeister considera este hydrolysis como proseguindo de acordo com a equação:

collagen + água = gelatin

mas em tratar das substâncias de tal composição variável,

as fórmulas empíricas deste tipo não têm nenhum significado grande).

Comercialmente, é preparado de determinados tipos dos ossos

e partes da pele. Estes são selecionados, lavados e extraídos

GELATIN 33

pela água e com um ácido diluído (hydrochloric), com rela tively pouca exposição ao calor, de modo que sómente possível dos produtos fluidos do disintegration do estoque sejam dados forma e a potência jellying da solução resultante não é destruída.

O gelatin do termo é derivado do gelare latin do verbo, para congeal, e chama-se para ocupar-se do atributo principal desta substância, aquele de sua propriedade endurecendo-se ou jellying.

O gelatin pertence a essa classe interessante das substâncias chamadas colóides. É um exemplo típico da classe, e exibe as propriedades características da classe. Os colóides, em contraste marcado aos crystalloids, não se cristalizam, prontamente não se difundem e são-se impermeable a se. As partículas finais dos colóides são muito menores do que o que nós denominaríamos ordinariamente uma subdivisão física, mas moléculas rather maior do que químicas; o diâmetro das partículas as menores em uma solução colloidal, por exemplo, ouro colloidal vermelho, que foram contadas por meio do ultra-micro espaço, é 6 millimicrons ou 6 milésimo de um mícron. Um mícron é um milésimo de um milímetro. (as bactérias são muito maiores, o visível o menor por meio do microscópio ordinário que é 0.3 a 1.0 mícron no diâmetro.) Conseqüentemente suas reações estão intermediárias entre o exame e as mudanças químicas da matéria, como pode ser visto considerando as propriedades do gelatin.

O gelatin absorverá uma quantidade considerável da água morna (é quase insoluble na água fria) e incha acima, rendendo uma geléia que, em cima da aplicação de calor, derreta a uma solução viscous, pegajosa que gelatinizes outra vez em cima de refrigerar. O nome do hydrogel é aplicado aos colóides que mostram esta propriedade. Os media ordinários do gelatin para o trabalho microbiological contêm o gelatin de 12% a de 15%. Quando secado em peratures médios do tem, o gelatin pode outra vez redissolved e redried dentro definitivamente. Desta propriedade é chamado um colóide reversível para distingui-la de outros colóides que, quando seu estado físico é mudado uma vez, são insoluble, por exemplo, casein e ácido silicic.

34 GENERAL MICROBIOLOGY

Se superdried em aproximadamente 130 C., ou superheated quando no estado gelatinous por um tempo curto em uma temperatura acima de 100 C., ou por muito tempo em 100 C., como na esterilização mittent inter, o gelatin estiver assim que modificado que sua potência redissolving ou resolidifying respectivamente está perdida. Em superdrying, a perda da propriedade redissolving é colocada ao contato demasiado próximo das partículas constituent, uma mudança no estado físico; no gelatin superheated, a perda da potência resolidifying é provavelmente devido ao tion da molécula do gelatin, um fenômeno mais puramente químico do disintegra. Esta perda da propriedade gelatinizing também é causada pelas atividades enzymic de muitos microorganisms e é também um processo do disintegration.

O gelatin possui um ponto do liquefaction que, entretanto, varie consideravelmente sob circunstâncias diferentes. Ordinariamente, os media que contêm o gelatin de 12% a de 15% liquefy ou para derreter em uma temperatura na vizinhança de 24 a 26 C., solidify o ing outra vez em 8 a 10 C. a uma geléia desobstruída, transparente. Consequentemente, os media do gelatin podem ser empregados somente para os organismos que não requerem uma temperatura mais alta do que 22 a 24 C. para o desenvolvimento. Superaquecer no processo da preparação ou da esterilização causará abaixar considerável do ponto do liquefaction, talvez finalmente assim baixo que o media será líquido na temperatura de quarto (20 a 21 C.) Prontamente ver-se-á como o último media do gelatin não poderia acessìvel ser usado para o tion do isola dos organismos. Alguns dados ajudarão em reparar isto na mente.

A propriedade solidifying do gelatin varia na proporção inversa com a época de aquecer-se durante o processo da esterilização; seu ponto liquefying é abaixado em uma média de 2 C. para cada hora de aquecer-se em 100 C. Isto faz claramente porque tal cuidado deve ser tomado na preparação de um media do gelatin, na esterilização fracionária deste media no vapor fluindo, e porque refrigerar imediato é aftei necessário; cada fractionation no processo de sua preparação.

GELATIN 35

Embora as temperaturas acima de 100 C. sejam muito mais destrutivas à propriedade solidifying do que aquela de 100 C., é possível sterilize um media que contem 12% a 15% do gelatin no autoclav (7 a 8 Ibs. Pressão) em 112 a 113 C. por vinte minutos ou em 15 Ibs. Pressão (120 C. por cinco minutos) sem danificar sua utilidade como um media de cultura contínuo.

É quase certo que este uso do vapor sob a pressão (vapor seco) é quase necessário no exemplo de um media do gelatin para efetuar o zation do sterili, desde que gelatin, de sua fonte, de método da preparação, e de umas responsabilidades mais atrasadas à contaminação, conter ou carregar em cima de sua superfície um grande número spores muito resistentes. O heating em 100 C. por trinta minutos em três ou nivela quatro ou cinco dias consecutivos não são sempre eficientes, porque estes spores não germinate sempre dentro de twenty-four horas após o heating e, consultando aos dados acima, ele são vistos prontamente que abaixar do ponto do faction do lique não deve ser considerado como insignificante no processo da esterilização intermitente.

O gelatin possui uma outra propriedade que renda valioso para o trabalho bacteriological: isto é, no gelatin a placa não cultiva nenhuma água da condensação coleta ordinariamente na tampa do prato de petri (como com ágar) mais tarde para deixar cair na superfície do gelatin e para obliterate assim formulários das colônias e para fazer com que as colônias isoladas tornem-se contaminadas com as neighboring. Armazenar deste media nos tubos de teste ou nas placas, sterile ou inoculado, é rendido assim muito mais simples do que com ágar.

REFERÊNCIA

CAMIONETE DERHEIDE, C.C.: Der Nahrgelatine de Verflussigungspunkt do und de Gelatinose Losungen, arco. F. Hyg., Bd. 30, 1897, pp. 82-115.

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EXERCÍCIO 8. PREPARAÇÃO DO GELATIN NUTRIENTE

Instrumento. infusion sterile da carne de 500 c.c.; água da torneira de 500 c.c.; 150 gms. Gelatin; 10 gms. Peptone, Witte; 5 gms. Sal; 10 gms. Albumen do ovo (ou um ovo); banho da água; termômetro; balde de 3.5 ware da ágata do litro; haste agitando pesada longa; instrumento do titration; NaOH N/20; NaOH De N/l; phenolphthalein (indicador); água destilada; ances grosseiros do bal; queimador de gás grande; funil grande; papel de filtro plaited; funil de enchimento; tubos de teste sterile; 500 c.c sterile. Flasks de erlenmeyer; instrumento para a esterilização do vapor; banho ou refrigerador da funcion-água.

Método. 1. Ponha os índices de um flask do infusion da carne (500 c.c.) em um balde da ágata e adicione 500 c.c. da água da torneira.

2. Adicione o gelatin de 15%, o peptone de 1% Witte, e o 0.5% sal à mistura.

3. Aqueça esta mistura em um banho da água para dissolver o gelatin, o peptone e o sal, agitando ocasionalmente.

4. Esfrie a 40-50 C. Isto é imperativo.

5. Adicione então 10 gms. Do albumen do ovo que foi misturado bem com os 100 c.c. da água da torneira. (posto o albumen do ovo em um tumbler, adicione bastante água para dar forma a uma pasta e para a agitar até que liso; adicione então a água restante. Um ovo batido bem pode ser substituído.) Misture tudo completamente.

6. Calor no vapor fluindo por minutos forty-five ou no autoclav em 105 C. por trinta minutos.

7. Titrate com NaOH N/20.

8. Ajuste a reação do media a +15 com NaOH normal ou o HC1 normal. Re titrate e ajuste outra vez se necessário.

9. O counterpoise e anota o peso.

10. Ferva quinze minutos sobre a flama livre, agitando con stantly.

11. Counterpoise e restaure toda a perda pela evaporação com água destilada.

12. Filtre ao ferver o papel de filtro plaited direto quente

ÁGAR 37

apenas lavado previamente com água fervendo do litro de 1/2. Passe o filtrate através do mesmo papel até que esteja brilhante e desobstruído.

13. Encha trinta tubos de teste sterile, usando aproximadamente 8 c.c. do media para cada tubo. Divida o restante em duas parcelas iguais e coloque-o em flasks de erlenmeyer sterile do litro de 1/2.

14. Aqueça no vapor fluindo vinte minutos em três dias sucessivos.

15. Refrigere o gelatin em um banho da funcion-água, imediatamente depois de cada heating. Cuidado deve ser tomado para aquecer o menos possível o gelatin, desde que a parte da potência solidifying do gelatin é perdida com cada aplicação de calor.

16. Para sterilize um flask grande do gelatin nutriente, calor por vinte minutos em quatro dias na sucessão.

ÁGAR

O ágar ou o ágar-ágar (de um meaning malay do "tabela da palavra vege"), a substância que é usada em preparar um tipo do media de cultura contínuo para o trabalho bacteriological, são um duto pro preparado dos vários seaweeds encontrados perto do Oceano Índico e em águas chinesas e japonesas. Este tipo de seaweed tem diversos nomes comuns, como o musgo de Ceilão ou de Jaffna, o isinglass de Bengal, etc.. As várias espécies são usadas para o alimento e o comércio é considerável.

Payen, um -(about francês do químico 1859), obteve a geléia do ágar do seaweed, corneum de Gelidium, na maneira lowing do fol: Foi permitido ao seaweed estar por alguma hora em uma solução diluída fria do ácido hydrochloric; o ácido foi removido enxaguando diversas vezes com água, a seguir o seaweed foi colocado em uma solução diluída fria da amônia; a amônia foi removida em seguida enxaguar repetido com água fria. Durante este processo, o seaweed perdeu 53% de seu peso em sais minerais, na matéria colorindo, e em constituents orgânicos. A parcela restante foi fervida na água,

38 GENERAL MICROBIOLOGY

durante que processo a geléia vegetal foi extraída. A solução assim que obtido foi derramada fora, saindo do sedimento inútil atrás. Esta geléia está a mesma na composição que que existindo nos tecidos vegetais; não foi mudada quimicamente, como é collagen na preparação do gelatin. O ágar comercial é preparado o mais provavelmente evaporando esta solução ao dryness por meios diferentes.

O ágar vem geralmente nas mãos do bacteriologist como por muito tempo, tiras delgadas, cinzento-brancas, ou como blocos, ou mais especial em anos recentes, no formulário de um der cinzento-branco do prisioneiro de guerra da manufatura européia.

O ágar, no contraste com gelatin, é um hidrato de carbono, isto é, consiste em uma combinação do carbono, do hidrogênio e do oxigênio somente. Os traços do nitrogênio estão atuais como impurezas. As determinações qualitative acima de seus uents elementares do constit foram feitas por Payen, por Parumbaru e por Hueppe, que fêz suas determinações no ágar das fontes diferentes. Tanto quanto pode ser verificado, sua fórmula empírica não foi investigada ainda a nenhuma extensão.

Como o gelatin, entretanto, o ágar é um colóide reversível. Embebe acima na água fria, dissolve-se na água quente após ferver longo a uma solução desobstruída tasteless e inodora, e em ifies contínuos em cima de refrigerar ao mais ou a menos geléia opaca. Sua solução aquosa é neutra ou quase ponto morto ao phthalein do phenol; ainda, uma gota ou dois do vigésimo hydrate normal do sodium são suficiente fazer a cor cor-de-rosa perceptível.

As propriedades colloidal do ágar não são destruídas por um heating longo-continuado em uma alta temperatura, nem pela ação de microorganisms ordinários como são aqueles do gelatin. As propriedades acima, entretanto, são influenciadas e podem completamente ser danificadas pela reação do líquido em que o ágar é dissolvido.

A reação do líquido, isto é, se é ácida ou alcalina, influencia o ágar a respeito de seus solubility, solidity, cor, transparência, filterability e quantidade de água do tion do condensa. Se o ágar for dissolvido em um líquido de um acidity

ÁGAR 39

o equivalente a 0.1% HC1, o ágar dissolve-se muito prontamente, filtra rapidamente, o filtrate resultante que é uma solução amarela, transparente, slippery, aquosa clara que não solidify em cima de refrigerar. Se uma porcentagem menor do ácido chloric hydro for usada, o solidification ocorre (abaixo de 40 C.) mas a geléia "não estará acima" e é conseqüentemente inútil para culturas da inclinação ou da placa de ágar. Uma quantidade grande de água con do densation está atual também.

Se o ágar for dissolvido em um caldo de carne alcalino ou neutro fraco, um líquido grosso, reddish-brown, viscous é que filtra lentamente e solidifies rapidamente em 40 C., a uma geléia muito contínua, opaca, seca, ter obtido mas pouca água da condensação; retem sua forma bem nas inclinações e nas placas. Assim o valor do ágar como um media de cultura contínuo é levantado ou abaixado de acordo com o cjegree do alkalinity ou do acidity.

Deve-se anotar além, entretanto, que quando a propriedade solidifying do ágar é destruída uma vez pela presença de um excesso do ácido em sua solução, esta propriedade pode nunca regained pela neutralização com alcalóide; o ácido por manently destrói o reversibility do colóide.

O melting-point do ágar (de 1.5% na solução neutra) é 97 C. e embora seu ponto solidifying esteja em 40 C., quando uma vez que solidified ele estará acima no termostato em uma temperatura de 50 C. Para finalidades bacteriological, somente esse formulário do ágar pode ser usado que remanesce fluido em 38 a 40 C. Ágar que remanesce fluido somente em uma temperatura acima deste ponto estaria demasiado quente quando em um estado fluido para o uso; o vitality dos organismos introduzidos seria danificado ou destruído pela alta temperatura.

As dificuldades são encontradas na preparação de um media de cultura contínuo do ágar, devido a seus solubility lento, cosity do vis e filterability lento conseqüente. Sua solução (digestão) é efetuada, como mencionado acima de, por um heating longo em um water-bath, em um sterilizer do vapor, em um autoclav, ou em um excesso uma flama livre. O comprimento de tempo requerido para a digestão completa depende em cima de três coisas: A reação do

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líquido em que o ágar é dissolvido, o índice dos por cento do ágar, e o método de dissolver-se. A influência da reação de soluções do ágar foi tratada acima. Para o uso geral da cultura, entretanto, o ágar ordinário é feito a uma escala +15 mais cheia (o ágar solidifies com dificuldade acima de uma escala +30 mais cheia).

O ágar de um por cento é muito mais fàcilmente soluble sob circunstâncias iguais do que um por cento mais elevado. Um e um meios por cento são a quantidade usada em media ordinários do ágar, dando uma geléia um tanto mais dura e assim mais desejável.

O ágar é digerido o mais ràpidamente sobre uma flama livre. If.not aquecido suficientemente, após o filtration e a esterilização do ágar pelo método intermitente, um itate flocculent do precip aparece freqüentemente no media previamente desobstruído. Isto pode ser feito para desaparecer em a maioria de casos sujeitando à temperatura do autoclav (120 C. 15 Ibs.).

O ágar para media de cultura dever estar inteiramente desobstruído quando líquido, e homogênea opaco-translúcido quando sólido; deve ter um translucence suficiente permitir colônias profundas nas placas ou nas culturas do stab a ser observadas prontamente; não deve conter o material, o sedimento, ou partes flocculent de papel do algodão ou de filtro, como estes hinder o desenvolvimento típico da colônia dos microorganisms e, ao inexperienced, podem certas vezes ser confundidos por colônias.

Nos primeiros métodos usados sempre fazendo os media de cultura do ágar, em vez de filtrar o ágar quente através do papel de filtro, do algodão absorvente, ou do asbesto, foi permitido refrigerar, ing do dur que processam o sedimento estabelecido ao fundo; quando o sólido o sedimento foi cortado fora. Este método não era desejável, porque o clearness do ágar resultante dependeria em cima da taxa de refrigerar; mais lento refrigerar, mais completamente sedimentation ocorreria.

O ágar não é um alimento para microorganisms no general, isto é, não é afetado pelos enzymes digestivos de a maioria de bactérias, como é gelatin. Entretanto, algumas bactérias são sabidas que têm a potência do ágar liquefying, entre que é B.

PREPARAÇÃO DO ÁGAR NUTRIENTE 41

os sp. do gelaticus n. (gran) e Mau Nenckii, ambos que são encontrados, como se esperaria, na água de mar. Este inertness tive do compara do ágar rende valioso para a preparação, dos media sintéticos contínuos, o valor de que pode ser en hanced sujeitando o ágar comercial ao fermentation natural durante que processo todos os traços de substâncias capazes do alimento do proveito são usados acima pelos microorganisms atuais. (Beijerinck.)

O ágar é do uso especial no trabalho bacteriological em que o cultivation dos microorganisms deve ser conduzido em uma temperatura acima do melting-point do gelatin. Esta característica fêz possível os strides grandes que foram feitos exame no bacteriology médico, tantas como bactérias pathogenic pode ser isolada e crescido somente com dificuldade em tures do tempera abaixo daquele do corpo.

REFERÊNCIAS

SMITH, ERWIN F.: Bactérias com relação às doenças de planta. Vol. I,

pp. 31-36. Diversas ilustrações. SCHULTZ, N. K.: Einiger Nahrsubstrate de Zur Frage von der Bereitung.

Centavo. F. Bakt. I. Orig., Bd. 10, 1891, p. 57.

EXERCÍCIO 9. PREPARAÇÃO DO ÁGAR NUTRIENTE

Instrumento. balde de 3.5 ágata-agate-ware do litro; 15 gms. Ágar; 10 gms. Peptone; 5 gms. Sal; 10 gms. Albumen do ovo (ou um ovo); infusion sterile da carne de 500 c.c.; água da torneira de 500 c.c.; instrumento do titration; NaOH N/20; NaOH De N/l; phthalein do phenol (indicador); água destilada; funil grande; papel de filtro plaited; funil de enchimento; tubos de teste sterile; flask sterile do litro; contrapesos grosseiros; queimador de gás grande; copo de medição de 1 litro; instrumento para a esterilização do vapor.

Método. 1. Em gms de um lugar 15 do balde dos ware da ágata de 3 litros. Do ágar em 500 c.c. da água da torneira.

2. Lave o ágar bem, separando os shreds e o ing do squeez ele através das mãos.

3. Decant a água suja, medindo a quantidade derramada

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MICROBIOLOGY GERAL

fora de; substitua com a mesma quantidade de água limpa da torneira.

Repita.

4. Dissolva sobre uma flama e uma fervura livres por cinco minutos, agitando constantemente. O tion do solu deve estar inteiramente livre das protuberâncias do ágar.

5. Adicione o peptone de 1% Witte e o 0.5% sal ao ágar fervendo.

6. A 500 c.c. da carne na fusão adicione 10 gms. Do al do ovo bumen que foi misturado bem com os 100 c.c. da água da torneira. (posto o albumen do ovo em um tumbler e adicione bastante água para dar forma a uma pasta. Agite até liso e adicione então a água do ing remanescer. Um ovo; poço batido,

Fig. 9. O funil da água quente para pode ser substituído.) Misture todo o ágar ou gelatin filtrando. Completamente

7. Derrame a mistura derretida do ágar lentamente no infusion da carne, agitando constantemente. Calor no autoclav em 120 C. por minutos forty-five ou por uma hora no vapor fluindo.

Nota. O momento para este heating pode ser alongado à vantagem, mas nunca ser encurtado. Se o ágar não for aquecido suficientemente antes do filtration, um precipitate flocculent dará forma nos tubos em cima de aquecer-se no vapor fluindo. Em a maioria de casos isto pode ser causado desaparecer aquecendo-se por um tempo curto no autoclav em 15 Ibs.

8. Titrate com NaOH N/20.

9. Ajuste a reação do media a +15 com NaOH normal ou o HC1 normal. Retitrate e reajusta a reação se necessário.

10. O counterpoise e anota o peso.

11. Ferva quinze minutos sobre uma flama livre, agitando con stantly,

SOLUÇÃO 43 DO PEPTONE DE DUNHAM

12. Counterpoise e faça acima toda a perda no peso com ferver a água destilada.

13. Filtre o papel de filtro plaited direto quente fervendo apenas lavado previamente com água fervendo. Passe o filtrate através do mesmo papel até que desobstruído.

14. Tubos de teste sterile da suficiência 60 a 70, usando aproximadamente 8 c.c. do media para cada tubo.

15. Aqueça no vapor fluindo vinte minutos em três dias cessive do suc.

16. Na extremidade do heating final, coloque os tubos do ágar em uma posição inclined para solidify (não permita que o media toque no plugue) de modo que uma superfície grande seja sented pre para o cultivation dos microorganisms. Estes são chamados inclinações de ágar.

Nota. Se os tubos do ágar deverem ser usados somente para inclinações de ágar, menos do media está necessitado no tubo do que quando deve ser usado para o chapeamento.

17. Para sterilize um flask grande do ágar, calor por trinta minutos em quatro dias sucessivos.