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Um espectrómetro maciço é baseado no simples facto de que os produtos químicos diferentes têm massas diferentes, e este é o que determina que produtos químicos estão atuais em uma amostra. Há muitos tipos de espectrómetros maciços que não somente para analisar diferentemente os íons mas para produzir tipos diferentes de íons; entretanto todos usam-se elétrico e campo magnèticos para mudar de uma certa maneira o trajeto dos íons.
Durante os finais dos 80 e o começo dos 90, dois métodos novos da ionização da amostra fizeram com que a espectrometria maciça submetesse-se a uma volta na análise do biopolymer, a saber ESI 38 e MALDI.39 apenas sobre uma década há, pela primeira vez, as técnicas spectrometric da massa que poderiam medir as massas moleculars de quantidades do femtomole de proteínas superiores do kDa 100, para melhorar frequentemente do que 0.01% exatidões, tornou-se extensamente - disponível aos químicos da proteína. Estes métodos são ambo o bem sucedidos em dar forma íons das grandes, biomoléculas labile sem degradação significativa do analyte. São não somente ambas as técnicas sensíveis mas também rápido - os espectros da seqüência do MS e do MS/MS podem ser adquiridos dentro dos segundos. ESI e MALDI, devido a suas muitas diferenças, são complementares e muitos laboratórios do biopolymer têm o acesso a ambas as técnicas.
A separação, a isolação e a preparação da amostra para as técnicas spectrometric maciças geralmente, envolvem 2-DE (2-Dimenisional electroforese), uma técnica que possa separar o tanto como como 5000 proteínas diferentes em uma única experiência. Geralmente, 2-DE é capaz de separar proteínas dentro de uma escala isoeléctrica do ponto (pI) de 3.5-10 e das massas moleculars que variam de 6 ao kDa 300, assim como podendo distinguir entre proteínas modificadas borne-translationally (por exemplo phosphorylated) e seus companheiros não-modificados. Uma vez que separados, os componentes de proteína são revelados por técnicas de mancha (por exemplo mancha de prata, mancha fluorescente, azul de Coomassie) e localizado uma vez podem então ser extraídos do gel. As proteínas não podem facilmente eluted dos geles sem o uso dos detergentes, que são prejudiciais à análise spectrometric maciça; adicionalmente, as grandes proteínas tendem a ser heterogêneas (por exemplo em conseqüência do glycosylation) e assim que não possuem nenhuma massa molecular que pode ser relacionada à entrada de correspondência em uma base de dados. Para superar estes obstáculos, a etapa da eluição tende a ser realizada depois que a proteína foi digerida por uma lavagem aquosa do acetonitrilo de uma parte extirpada do gel. Isto aumenta o rendimento da extração 5 e usando um método da digestão do em-gel que emprega o trypsin, que foi descrito e é amplamente utilizado como publicado ou com modificações menores, produz uma amostra Senhora-compatível de que uma identificação da proteína pode ser feita. A etapa da digestão pode ser precedida por uma etapa opcional da redução e do alkylation para fender e obstruir as pontes de bissulfeto que existem entre resíduos do cysteine. Os sistemas robóticos foram desenvolvidos para automatizar a excisão de pontos da proteína da 2D-gel, para realizar a digestão enzymatic subseqüente e para transferir as amostras em MALDI-MS alveje placas para a análise inicial do MS. Para muitas aplicações, os peptides recuperados das digestões do em-gel exigem a concentração e a purificação antes de ser analisada pela espectrometria maciça especial se ESI é o método da ionização usado. Invertido - líquido do elevado desempenho da fase
a cromatografia (HPLC) é um método de conseguir isto; um outro método envolve o uso material da perfusão de ZipTips (millipore) (pontas da pipeta embaladas com material C18) ou de Poros R2 (biosistemas de Perseptive). Apesar de sua aceitação difundida, as limitações de 2-DE incluem a exclusão de proteínas muito pequenas ou muito grandes, de proteínas muito ácidas ou muito básicas, e também proteínas hydrophobic tais como proteínas da membrana. Pensa-se isso
somente 20% das proteínas gel-carregadas pode ser visualizado e analisado. Outros confinamentes são que a quantidade de amostra que pode ser carregada é limitada causando o não cumprimento de
as baixas proteínas da concentração e igualmente isso as técnicas de mancha as mais de uso geral têm fatores de resposta não-lineares. Na prática, 2-DE é um trabalho - processo intensivo que envolve as etapas do trabalho manual que oferecem a oportunidade para impurezas tais como a queratina de contaminar as amostras. Um 2-D gel tomará um dia para terminar e aproximadamente um mês para uma análise estrutural completa pelo MS, embora a automatização possa ajudar o problema de contaminação e acelerar a análise em certa medida.
A alternativa, métodos Senhora-compatíveis da preparação da proteína está sob o desenvolvimento mas ninguém tecnologia emergeu como uma recolocação universal. Estes métodos apontam geralmente conectar a amostra da proteína diretamente às análises de MS/MS que eliminam desse modo etapas demoradas da preparação da amostra e a necessidade para uma análise preliminar do MS. A focagem isoeléctrica capilar (CIEF) - MS e a focagem isoeléctrica preparative seguida pela exclusão chromatography-MS do tamanho são os métodos que foram detalhados comparado com o 2-DE nos termos do effciency da separação, da capacidade máxima, da precisão e do vigor, com anterior aparecer a alternativa mais favorável. A análise direta de misturas complexas do peptide de uma mistura das proteínas usando-se em linha, - cromatografia líquida do elevado desempenho da fase (HPLC) - MS/MS invertido estêve usada com sucesso enquanto uma alternativa a 2DE e a este conduziu na cromatografia multidimensional se a maior separação do peptide é desejável antes das análises de MS/MS. Os exemplos da cromatografia bidimensional incluem o aníon ou troca de cation seguida pelo invertido - pnha em fase a cromatografia da exclusão da HPLC e do tamanho seguida pelo invertido - pnha em fase a HPLC. Outra, aproximação alternativa foi usar a micro-extração solid-phase combinada junto com a electroforese capilar (CE) acoplada a ESI MS/MS para a análise de um sumário tryptic da proteína total. Este método teve recursos para a separação de alta resolução dos fragmentos do peptide permitindo a identificação de 80-90% das proteínas neste complexo particular do ribosome do fermento. Acoplar dispositivos microfluidic ao MS é uma estratégia mais adicional que combine a amostra que segura e separação, e também o conexão ordenadamente com a análise nano-ESI-MS. Uma aproximação diferente para o fraccionamento e a identificação seletivos da proteína usa a tecnologia de ProteinChip (Ciphergen) que emprega um método de superfície da captação usando anticorpos ou superfícies quimicamente modificadas para capturar classes específicas de proteínas que são analisadas então por MALDI-MS. Esta técnica, conhecida como a ionização realçada superfície da dessorção do laser (SELDI) - MS35, tem o grande potencial para a comparação do índice de proteína de amostras diferentes.
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