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Spectrometry Maciço

Que é um spectrometer maciço?

Um spectrometer maciço é baseado no fato simples que os produtos químicos diferentes têm massas diferentes, e este é o que determina que produtos químicos estão atuais em uma amostra. Há muitos tipos de spectrometers maciços que não somente para analisar diferentemente os íons mas para produzir tipos diferentes de íons; entretanto todos usam-se campos elétricos e magnéticos mudar o trajeto dos íons em alguma maneira.

Durante os 1980s atrasados e os 1990s adiantados, dois métodos novos do ionization da amostra fizeram com que o spectrometry maciço submetesse-se a uma volta na análise do biopolymer, a saber ESI 38 e MALDI.39 apenas sobre uma década há, para a primeira vez, as técnicas spectrometric maciças que poderiam medir as massas molecular de quantidades do femtomole das proteínas em um excesso do kDa 100, para melhorar frequentemente do que 0.01% exatidão, tornou-se extensamente disponível aos químicos da proteína. Estes métodos são ambo o bem sucedidos em dar forma a íons dos biomolecules grandes, labile sem degradação significativa do analyte. São não somente ambas as técnicas sensíveis mas da seqüência speedy – também os spectra do MS e do MS/MS podem ser adquiridos dentro dos segundos. ESI e MALDI, devido a suas muitas diferenças, são complementares e muitos laboratórios do biopolymer têm o acesso a ambas as técnicas.

Preparação da amostra: electrophoresis 2-Dimensional e spectrometry maciço

A separação, a isolação e a preparação da amostra para as técnicas spectrometric maciças geralmente, envolvem 2-DE (2-Dimenisional electrophoresis), uma técnica que possa separar o tanto como como 5000 proteínas diferentes em uma única experiência. No general, 2-DE é capaz de separar proteínas dentro de uma escala isoelectric do ponto (pI) de 3.5–10 e das massas molecular que variam de 6 ao kDa 300, assim como podendo distinguir entre proteínas modificadas borne-translationally (por exemplo phosphorylated) e seus companheiros non-modificados. Uma vez que separados, os componentes de proteína são revelados por técnicas manchando (por exemplo mancha de prata, mancha fluorescente, azul de Coomassie) e localizado uma vez podem então ser extraídos do gel. As proteínas não podem fàcilmente eluted dos gels sem o uso dos detergentes, que são prejudiciais à análise spectrometric maciça; adicionalmente, as proteínas grandes tendem a ser heterogêneas (por exemplo em conseqüência do glycosylation) e assim que não possuem nenhuma massa molecular que pode ser relacionada à entrada correspondente em uma base de dados. Para superar estes obstáculos, a etapa do elution tende a ser realizada depois que a proteína foi digerida por uma lavagem aqueous do acetonitrilo de uma parte excised do gel. Isto aumenta o rendimento da extração 5 e usando um método da digestão do em-in-gel que emprega o trypsin, que foi descrito e é usado extensamente como publicado ou com modificações menores, produz uma amostra MS-compatível de que uma identificação da proteína pode ser feita. A etapa da digestão pode ser precedida por uma etapa opcional da redução e do alkylation para cleave e obstruir as pontes do bissulfeto que existem entre resíduos do cysteine. Os sistemas robotic foram desenvolvidos para automatizar o excision de pontos da proteína da 2D-gel, para realizar a digestão enzymatic subseqüente e para transferir as amostras em MALDI-MS alveje placas para a análise inicial do MS. Para muitas aplicações, os peptides recuperados das digestões do em-in-gel requerem a concentração e o purification antes de ser analisada pelo spectrometry maciço especial se ESI é o método do ionization usado. Líquido invertido do desempenho elevado da fase
o chromatography (HPLC) é um método de conseguir isto; um outro método envolve o uso material do perfusion de ZipTips (millipore) (pontas da pipeta embaladas com material C18) ou de Poros R2 (biosystems de Perseptive). Apesar de sua aceitação difundida, as limitações de 2-DE incluem a exclusão de proteínas muito pequenas ou muito grandes, de proteínas muito acidic ou muito básicas, as.well.as proteínas hydrophobic tais como proteínas da membrana. Pensa-se isso
somente 20% das proteínas gel-carregadas pode ser visualizado e analisado. Outros confinamentes são que a quantidade de amostra que pode ser carregada é limitada causando o non-observance de
as proteínas baixas da concentração e também isso as técnicas manchando o mais geralmente usadas têm fatores non-linear da resposta. Na prática, 2-DE é um processo intensive labour que envolve as etapas da manipulação manual que oferecem a oportunidade para impurezas tais como o keratin de contaminar as amostras. Um 2-D gel fará exame de um dia para terminar e de aproximadamente um mês para uma análise estrutural completa pelo MS, embora a automatização possa ajudar ao problema e à velocidade de contaminação acima da análise a alguma extensão.

Técnicas alternativas da separação da proteína

A alternativa, métodos MS-compatíveis da preparação da proteína está sob o desenvolvimento mas no.one tecnologia emergiu como uma recolocação universal. Estes métodos apontam geralmente conectarar a amostra da proteína diretamente às análises de MS/MS que eliminam desse modo etapas time-consuming da preparação da amostra e a necessidade para uma análise preliminar do MS. Focalizar isoelectric capilar (CIEF)-MS e focalizar isoelectric preparative seguidos pelo chromatography-chromatography-MS da exclusão do tamanho são os métodos que foram comparados na profundidade com o 2-DE nos termos do effciency da separação, da capacidade peak, da precisão e do robustness, com anterior aparecer o alternative.The mais favorável dirigem a análise de misturas complexas do peptide de uma mistura das proteínas se usando em linha, chromatography líquido invertido de desempenho elevado da fase (HPLC)-MS/MS estêve usado com sucesso enquanto uma alternativa a 2DE e a este conduziu no chromatography multidimensional se uma separação mais grande do peptide for desejável antes das análises de MS/MS. Os exemplos do chromatography bidimensional incluem a troca do anion ou de cation seguida pelo chromatography invertido da exclusão do HPLC e do tamanho da fase seguido pelo HPLC invertido da fase. Outro, aproximação alternativa foi usar a micro-extração solid-phase combinada junto com o capilar electrophoresis(CE) acoplado a ESI MS/MS para a análise de um sumário tryptic da proteína total. Este método teve recursos para a separação de alta resolução dos fragmentos do peptide permitindo a identificação de 80–90% das proteínas neste complexo particular do ribosome do fermento. Acoplar dispositivos microfluidic ao MS é uma estratégia mais adicional que combine a manipulação e a separação da amostra, as.well.as o conexão ordenadamente com a aproximação diferente do nano-ESI-nano-ESI-MS analysis.A para o fractionation seletivo da proteína e a identificação usa a tecnologia de ProteinChip (Ciphergen) que emprega um método de superfície da captação usando antibodies ou superfícies quimicamente modificadas capturar classes específicas das proteínas que são analisadas então por MALDI-MS. Esta técnica, sabida como a superfície realçou o ionization do desorption do laser (SELDI)-MS35, tem o potencial grande para a comparação do índice de proteína de amostras diferentes.