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Degradação Automatizada De Edman

As seqüências do amino-ácido podem ser determinadas pela degradação automatizada de Edman

A composição de amino-ácido do peptide é determinada.  O peptide hydrolyzed em seu amino-ácido constituent aquecendo o em 6 N HCl em 110°C por 24 horas.  Stanford Moore e William Stein mostraram que os aminos-ácido nos hydrolysates podem ser separados pelo chromatography do ionexchange em colunas de sulfonated o poliestireno e quantitated reagindo as com o ninhydrin. 

Os aminos-ácido trataram esta elasticidade da maneira uma cor azul intensa, à exceção do praline, que dá uma cor amarela porque contem um amino grupo secundário.  A concentração do amino-ácido em uma solução é proporcional ao absorbance ótico da solução após o heating ele com ninhydrin.  Esta técnica pode detectar um micrograma (10nmol) de um amino-ácido, que seja sobre a quantidade atual em um thumbprint. 

Tão pouco como um nanogram (pmol 10) de um amino-ácido pode ser detectado por meio do fluorescamine, que reage com o um-amino grupo de um produto altamente fluorescente.  A identidade do amino-ácido é revelada por seu volume do elution, que no volume do amortecedor se usou remover o amino-ácido da coluna. 

O resíduo do amino-terminal de uma proteína ou de um peptide pode ser identificado etiquetando o com um composto que dê forma a uma ligação covalent estável. 

Fluorodinitrobenzene (FDNB) foi usado primeiramente para esta finalidade por Frederick Sanger.  O cloreto de Dabsyl é usado agora geralmente porque dá forma aos derivatives intensa coloridos que podem ser detectados com sensibilidade elevada.  Reage com um grupo a-NH2 uncharged para dar forma a um derivative do sulfonamide que seja estável sob as circunstâncias que hydrolyze ligações do peptide. 

Embora o método do dabsyl para determinar o resíduo do amino-terminal seja sensível e poderoso, não pode ser usado repetidamente no mesmo peptide porque o peptide é degradado totalmente na etapa do ácido-acid-hydrolysis.  Pehr Edman planejou um método para etiquetar o resíduo do amino-terminal e cleaving o do peptide sem disrupting o peptide liga-se entre os outros resíduos do amino-ácido.  A degradação de Edman remove sequencialmente um resíduo de cada vez da amino extremidade de um peptide.  O isothiocyanate phenyl reage com o amino grupo terminal uncharged do peptide para dar forma a um derivative do phenylthiocarbamoyl.  Então, sob circunstâncias acidic mildy, um derivative cíclico do amino-ácido terminal liberated, que sae de um peptide intato encurtado por um amino-ácido.

As análises de estruturas da proteína foram aceleradas marcada pelo desenvolvimento dos sequenators, que são instrumentos automatizados para a determinação da seqüência do amino-ácido.  Em um sequenator liquid-phase, uma película fina da proteína em um copo cilíndrico girando é sujeitada à degradação de Edman.  Os reagents e os solventes extrair são passados sobre a película immobilized da proteína, e o PTH-amino ácido liberado é identificado pelo chromatography líquido de alta pressão (chamado também chromatography líquido, HPLC high-performance). 

Um ciclo da degradação de Edman é realizado em menos de duas horas.  Por degradações repetidas, a seqüência do amino-ácido de uns cinqüênta resíduos em uma proteína pode ser determinada.  Os sequenators gas-phase podem analisar quantidades do picomole dos peptides e das proteínas.  Esta sensibilidade elevada fá-lo praticável para analisar a seqüência de uma amostra da proteína eluted de uma única faixa de um gel do SDS-sDS-polyacrylamide.