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Estação molecular dos direitos reservados 2007
A mancha do sul é uma técnica nomeada após seus inventor e colaborador, biólogo britânico Edwin M. do sul em 1975. A mancha do sul é uma técnica que permita a deteção de uma seqüência específica do ADN (gene ou outro) em uma grande, amostra complexa de ADN (por exemplo ADN celular).
“Antes do PCR e jejua barato arranjando em seqüência mudou nossa opinião do universo que é genéticas, o borrão do sul era um laborioso universal. Não havia uma experiência na genética molecular que não empregou em um certo momento um borrão do sul. É ainda uma ferramenta útil e você precisa de saber sobre ela de modo que você possa interpretar dados históricos.”
Diagrama da técnica do sul do borrão. A figura é direitos reservados. Se você gostaria da usar para um projeto da leitura ou da ciência, contate-nos por favor para a permissão.
Em etapa 1, o ADN é digerido com endonucleases da limitação. O ADN High-molecular-weight é digerido em fragmentos menores.
Em etapa 2, O ADN é separado então para fora pelo tamanho pela electroforese em um gel do agarose.
Em etapa 3, uma folha da membrana do nylon ou da nitrocelulose (roxa) é coloc sobre o gel do agarose em uma solução de amortecedor. Isto é o estágio da mancha ou de transferência. A pressão aplicada uniformente ao gel usando a sucção ou coloc uma pilha das toalhas de papel e um peso sobre a membrana e o gel para assegurar mesmo o contato entre o gel e a membrana. Transferência do amortecedor pela ação capilar de uma região de potencial do ponto alto a uma região de potencial da baixa água (geralmente papel de filtro e tecidos do papel) é usada então para mover sobre o ADN do gel para a membrana. Positivamente - a membrana carregada (roxa) é usada geralmente que permite que o ADN ligue com afinidade elevada à membrana com as interações do íon entre negativamente - ADN carregado e positivamente - membrana carregada.
Em etapa 4, as membranas da nitrocelulose são cozidas pela exposição às altas temperaturas (°C) 60 a 100. As membranas de nylon são expor à radiação UV. Estas etapas sãas para assegurado a ligação transversal permanente e covalent do ADN atual nas faixas às membranas.
Em etapa 5, a membrana é expor a uma ponta de prova radiolabeled. Esta ponta de prova é um fragmento single-stranded do ADN que tenha sua seqüência do interesse que você quer detectar. Esta ponta de prova é incubada com a membrana e permitida cruzar com ADN na membrana. As pontas de prova são geralmente radiolabeled de modo que possam ser detectadas na película, porém umas pontas de prova mais novas são usadas igualmente que sejam non-radioactive como tinturas fluorescentes ou cromogéneas. Após a hibridação, o excesso ponta de prova unbound é lavado longe da membrana, saindo da ponta de prova especificamente limitada.
Em etapa 6, o teste padrão da hibridação está detectado pelo visualização na película de raio X pela autoradiografia no caso de umas pontas de prova radioativas ou fluorescentes, ou pelo desenvolvimento da cor na membrana se um método de deteção cromogéneo é utilizado.
(Notas para etapa 3: Se os grandes fragmentos do ADN estão atuais maior o kb de 15 no tamanho pode ser até lá ácido diluído depurinated do HCl antes da mancha que quebrará o ADN em partes menores, assim permitindo transferência mais eficiente do gel à membrana. Se os métodos alcalinos de transferência são usados, o gel do ADN está coloc em uma solução alcalina (que contem tipicamente o hidróxido de sódio) para desnaturar o ADN double-stranded. A desnaturação em um ambiente alcalino prevê o emperramento melhorado negativamente - ADN carregado á positivamente - da membrana carregada, separa-a em únicas costas do ADN para uma hibridação mais atrasada à ponta de prova (veja abaixo), e destrói-a todo o RNA residual que puder ainda estar atual no ADN.
ÁUDIO: Escute uma explanação do sul detalhada do borrão! Cortesia: Instituto de investigação humano nacional do genoma.
Como mencionado, o borrão do sul é uma técnica usada para identificar e encontrar as seqüências do ADN que são complementares a uma outra parte de ADN chamada uma ponta de prova.
A separação em um gel electrophoretic das seqüências ou dos fragmentos do ADN genomic ou complementar, digeridas parcialmente por endonucleases, os fragmentos então “é borrada” em uma membrana e permitida cruzar com um específico, etiquetado ponta de prova a fim detectar que faixas contêm o fragmento ou o gene do interesse. O borrão do sul é particular útil em detectar grandes rearranjos de gene/apagamentos e grandes expansões da repetição do trinucleotide.
Um borrão do sul é um método usado rotineiramente na biologia molecular para verific para ver se há a presença de uma seqüência do ADN em uma amostra do ADN. A mancha do sul combina a electroforese do gel do agarose para a separação de tamanho de ADN com os métodos para transferir o ADN tamanho-separado a uma membrana do filtro para a hibridação da ponta de prova. Outros métodos de mancha (isto é, borrão ocidental, borrão do norte, borrão do sudoeste) que emprega princípios similares, mas a utilização do RNA ou da proteína, têm sido nomeados mais tarde na referência ao nome do sul. Porque a técnica foi nomeada eponymously, o borrão do sul deve ser capitalizado, visto que os borrões do norte e ocidentais não devem.
É usado igualmente para determinar o peso molecular de um fragmento da limitação e para medir quantidades relativas em amostras diferentes.
Os borrões são técnicas para transferir proteínas do ADN e do RNA em um portador assim que podem ser separados, e seguem frequentemente o uso de uma electroforese do gel. O borrão do sul é usado transferindo o ADN.
A hibridação da ponta de prova a um fragmento específico do ADN na membrana do filtro indica que este fragmento contem a seqüência do ADN que é complementar à ponta de prova.
Os borrões do sul são usados em diversas áreas principais que incluem a descoberta e o traço do gene, estudos da evolução e do desenvolvimento, diagnósticos e forense.
Sob circunstâncias óptimas, a mancha do sul detecta a página do ~ 0.1 do ADN do interesse
Para fazer 1 litro do amortecedor de 20X SSC, adicione o seguinte:
Para problemas e a mancha do sul da pesquisa de defeitos, afixe uma linha nova para discuti-la no fórum da mancha do sul!
Digestão da enzima da limitação - tudo que você precisa de saber!
Protocolo da isolação do ADN de Genomic
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