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Os homens grandes da ciência são artistas supremos. ~Martin H. Fischer
Estação Molecular Do Copyright 2007
Borrar do sul é uma técnica nomeada após seus inventor e colaborador, biólogo britânico Edwin M. Do sul em 1975. Borrar do sul é uma técnica que permita a deteção de uma seqüência específica do DNA (gene ou outro) em uma amostra grande, complexa de DNA (por exemplo DNA celular).
"antes de PCR e fast barato arranjando em seqüência mudou nossa vista do universo que é genetics, o borrão do sul era um workhorse universal. Não havia uma experiência no genetics molecular que em algum estágio não empregou um borrão do sul. É ainda uma ferramenta útil e você necessita saber sobre ela de modo que você possa interpretar dados históricos."
O diagrama do borrão do sul technique.Figure é copyright. Se você gostar de o usar para um projeto do lecture ou da ciência, contate-nos por favor para a permissão.
Em etapa 1, o DNA é digerido com endonucleases da limitação. O DNA high-molecular-weight é digerido em fragmentos menores.
Em etapa 2, O DNA é separado então para fora pelo tamanho pelo electrophoresis em um gel do agarose.
Em etapa 3, uma folha de membrana do nylon ou do nitrocellulose (roxa) é colocada no alto do gel do agarose em uma solução de amortecedor. Isto é considerado o estágio borrando ou transferindo. A pressão é aplicada uniformente ao gel usando a sucção ou colocando uma pilha das toalhas de papel e um peso no alto da membrana e do gel para assegurar mesmo o contato entre o gel e a membrana. Transferência do amortecedor pela ação capilar de uma região do potencial elevado da água a uma região do potencial baixo da água (geralmente papel de filtro e tecidos do papel) é usada então mover sobre o DNA do gel para a membrana. A membrana positivamente carregada (roxa) é usada geralmente que permite que o DNA ligue com afinidade elevada à membrana com as interações do íon entre o DNA negativamente carregado e a membrana positivamente carregada.
Em etapa 4, as membranas do nitrocellulose são cozidas pela exposição às altas temperaturas ( °C 60 a 100). As membranas de nylon são expostas à radiação UV. Estas etapas são usadas assegurar a ligação transversal permanente e covalent do DNA atual nas faixas às membranas.
Em etapa 5, a membrana é exposta a uma ponta de prova radiolabeled. Esta ponta de prova é um fragmento único-encalhado do DNA que tenha sua seqüência do interesse que você quer detectar. Esta ponta de prova incubated com a membrana e é permitida hybridize com DNA na membrana. As pontas de prova são geralmente radiolabeled de modo que possam ser detectadas na película, porém umas pontas de prova mais novas são usadas também que sejam non-radioactive como tinturas fluorescentes ou chromogenic. Após o hybridization, a ponta de prova unbound adicional é lavada afastado da membrana, saindo da ponta de prova especificamente limitada.
Em etapa 6, o teste padrão do hybridization está detectado pelo visualization na película de raio X pelo autoradiography na caixa de umas pontas de prova radioativas ou fluorescentes, ou pelo desenvolvimento da cor na membrana se um método de deteção chromogenic for utilizado.
(notas para etapa 3: Se os fragmentos grandes do DNA
estiverem atuais mais extremamente de 15 kb no tamanho podem ser
depurinated pelo ácido então diluído de HCl antes de borrar que
quebrará o DNA em partes menores, assim permitindo transferência
mais eficiente do gel à membrana. Se os métodos alcalinos de
transferência forem usados, o gel do DNA está colocado em uma
solução alcalina (que contem tipicamente o hydroxide do sodium) para
desnaturar o DNA double-stranded. O denaturation em um ambiente
alcalino fornece para o emperramento melhorado do DNA negativamente
carregado a uma membrana positivamente carregada, separa-a em únicas
costas do DNA para um hybridization mais atrasado à ponta de prova
(veja abaixo), e destrói-o todo o RNA residual que puder ainda estar
atual no DNA.
ÁUDIO: Escute
uma explanação do sul detalhada do borrão! Cortesia: Instituto De Pesquisa Humano
Nacional Do Genome.
Como mencionado, o borrão do sul é uma técnica usada identificar e encontrar as seqüências do DNA que são complementares a uma outra parte de DNA chamada uma ponta de prova.
A separação em um gel electrophoretic das seqüências ou dos fragmentos do DNA genomic ou complementar, digeridas parcialmente por endonucleases, os fragmentos então ' é borrada ' em uma membrana e permitida hybridize com um específico, etiquetado ponta de prova a fim detectar que faixas contêm o fragmento ou o gene do interesse. O borrão do sul é particularmente útil em detectar o gene grande rearrangements/deletions e expansões grandes do repeat do trinucleotide.
Um borrão do sul é um método usado rotineiramente na biologia molecular verificar para ver se há a presença de uma seqüência do DNA em uma amostra do DNA. Borrar do sul combina o electrophoresis do gel do agarose para a separação do tamanho do DNA com os métodos para transferir o DNA tamanho-separado a uma membrana do filtro para o hybridization da ponta de prova. Outros métodos borrando (isto é, borrão ocidental, borrão do norte, borrão do sudoeste) que emprega princípios similares, mas usar o RNA ou a proteína, têm sido nomeados mais tarde na referência ao nome do sul. Porque a técnica foi nomeada eponymously, o borrão do sul deve capitalised, visto que os borrões do norte e ocidentais não devem.
É usado também determinar o peso molecular de um fragmento da limitação e medir quantidades relativas em amostras diferentes.
Os borrões são técnicas para transferir proteínas do DNA e do RNA em um portador assim que podem ser separados, e seguem frequentemente o uso de um electrophoresis do gel. O borrão do sul é usado transferindo o DNA.
O hybridization da ponta de prova a um fragmento específico do DNA na membrana do filtro indica que este fragmento contem a seqüência do DNA que é complementar à ponta de prova.
Os borrões do sul são usados em diversas áreas principais including a descoberta e traçar do gene, estudos da evolução e do desenvolvimento, diagnóstico e forensics.
Sob circunstâncias optimal, borrar do sul detecta a página do ~ 0.1 do DNA do interesse
Para fazer 1 litro do amortecedor de 20X SSC, adicione o seguinte:
Para problemas e borrar do sul de pesquisa de defeitos, afixe uma linha nova para discuti-la no forum borrando do sul!
Digestão do enzyme da limitação - tudo que você necessita saber!
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