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Protocolo Do Phosphatase Alcalino Do Shrimp do SAP

O phosphatase alcalino ou o SAP do shrimp, são um enzyme que catalyzes o dephosphorylation de 5’ phosphates das extremidades dephosphorylating do RNA ou do DNA do ácido nucleic.

Anote que os produtos de PCR e também primers não têm phosphatases em suas extremidades livres, e necessite-o conseqüentemente ser phosphorylated antes do cloning se você estiver indo usar um vetor de-de-phosphorylated!

O SAP está a uma temperatura instável é conseqüentemente você pode fàcilmente desativar este enzyme (comparado ao CIP!). O SAP é desativado com incubation do banho da água 65°C por 15 minutos.

Você não começa virtualmente nenhuma reação. O SAP requer ao menos o mgCl2 de 10mM (mas a atividade de enzyme optimal do phosphatase alcalino do shrimp está no mgCl2 de 20-25mM) e trabalha bem em pH 8.0.

Ao pmol do dephosphorylate 1 de extremidades do DNA

Ao pmol do dephosphorylate 1 das extremidades do DNA (2.5 ug do plasmid de 3 Kb), porque ao 1hr em 37°C que você necessita:

0.1 unidade do SAP para as saliências 5', 0.2 unidade para sem corte e 0.5 unidade para o excesso 3' penduram.
O enzyme vem 1 unidade por o ul, assim ser seguro você pode usar as unidades approx.0.5 para 2 ug.

PONTAS: O enzyme do SAP pode ser adicionado diretamente ao sumário da limitação! Assim a continuação inteira including a digestão do enzyme da limitação, o dephosphorylation, o inactivation de enzyme, o ligation ou os 5’ extremidade-etiquetando pode ser executada em um único tubo apenas adicionando os reagents apropriados. Isto permitirá que você conserve o tempo e seja eficiente!

Phosphatase Alcalino De Pesquisa de defeitos Do Shrimp do SAP?

Discuta e perguntas do borne sobre ele no forum do phosphatase alcalino do shrimp e do cloning do DNA !

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