Digestão da enzima da limitação

Enzimas da limitação

Índice da digestão da limitação

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Estação ©2006 molecular. Julho actualizado 2008.

Informação em como transformar-se um perito em enzimas da limitação e em ADN da digestão!

Fundo em enzimas da limitação

As enzimas da limitação (ou os endonucleases da limitação) são as enzimas que cortam o ADN double-stranded fazendo duas rupturas, uma com cada um das espinhas dorsais do fosfato da hélice dobro. A enzima faz esta sem danificar as bases do ADN. Embora a enzima quebre o ADN, as ligações químicas podem ser reformadas por outras enzimas conhecidas como ligase do ADN. Conseqüentemente, os fragmentos da limitação do ADN dos cromossomas ou dos genes diferentes podem ser ligados junto, fornecendo suas extremidades são complementares.

Utilidade de enzimas da limitação na biologia molecular

O fato de que o ADN poderia ser manipulado e as partes diferentes do ADN poderiam agora ser emendados junto, áreas de pesquisa novas abertas nunca antes do imaginado. Muitos dos métodos na biologia molecular confiam hoje em enzimas da limitação. A “limitação” é derivada do fato de que estas enzimas estiveram descobertas initally em Escherichia Coli que pareceu restringir a infecção de bacteriófagos específicos (“vírus” das bactérias). Acredita-se que enzimas da limitação é um mecanismo de defesa do anfitrião evoluído pelas bactérias e outros organismos para resistir infecções virais, e para as ajudar com a eliminação de seqüências virais.

Em 1978, o prêmio de Nobel para a medicina foi concedido a Werner Arber, a Daniel Nathans e a Hamilton Smith para sua descoberta dos endonucleases da limitação, que conduzem ao desenvolvimento de tecnologias de ADN de recombinação. O primeiro uso prático de enzimas da limitação na ciência e na medicina era a manipulação das bactérias de Escherichia Coli para expressar o insulin humano de recombinação para diabéticos.

Segurando e usando enzimas da limitação

Uma unidade de atividade de enzima da limitação é definida pela quantidade de enzima do restrition exigida para cortar 1 micrograma do ADN do lambda do bacteriófago à conclusão em um momento de 1 hora.

Os ensaios desenvolvidos pelo fabricante das enzimas são mais provável feitos usando o ADN altamente purified (isto é plasmídeo ou ADN do fago do lambda) como a carcaça, e o ensaio condiciona que produz os melhores resultados com sua preparação particular. Frequentemente as condições do laboratório não são como o ideal, e um excesso ligeiro de enzima ou de um período de incubação mais longo é usado para ajudar a assegurar a digestão completa.

Há muitos amortecedores “universais” da enzima que trabalharão com uma variedade de enzimas, mas frequentemente não cumprem as exigências as mais eficientes para nenhuma uma enzima. Porque os amortecedores universais não são como eficientes, nós não recomendamos seu uso corrente no laboratório (especial para DNAs genomic complexo; os sumários de DNAs genomic complexo estão geralmente nas concentrações elevadas do ADN que inibirão a enzima; também, as preparações relativamente cruas do ADN podem conter inibidores que exige mais tempos mais longos da incubação do ard da enzima das unidades para a digestão completa). É sempre o melhor usar as condições recomendadas do ensaio do fabricante para a digestão do restricition. Alguns fabricantes clonaram as enzimas que têm exigências muito diferentes de outras versões da mesma enzima, assim que verific antes de usar. As concentrações da enzima são dadas sempre no lado do tubo da enzima. As enzimas da limitação usadas no laboratório são armazenadas sempre em -20 graus C (em uma base do glicerol), e devem ser mantidas tão perto a -20 graus C como possível estender a vida da enzima. Ao setting-up sumários, traga o tubo da reação ao congelador da enzima em uma cubeta de gelo; remova o tubo da enzima do congelador e mantenha o tubo no gelo ao trabalhar com a enzima. Retorne imediatamente o tubo ao congelador quando terminado. Use o pipetmen designado para enzimas da limitação somente e use sempre uma ponta pipetman fresca ao remover a enzima do tubo conservado em estoque.

Pontas no uso da enzima da limitação

• Todo o fabricante de enzimas da limitação fornece amortecedores específicos com as enzimas, e estes devem ser armazenados no congelador de -20°C. As enzimas da limitação devem igualmente ser armazenadas em -20°C.
• Nunca compo sumários da limitação com a enzima da limitação que compor mais de 1/10 do volume final. Isto é devido ao fato de que as proteínas de enzima da limitação estão armazenadas no glicerol. Em concentrações acima de 10%, o glicerol inibe não somente a digestão mas igualmente pode causar a atividade da estrela - conduzindo aos cortes aberrantes, não específicos do ADN.
• Setup um sumário do controle ao usar enzimas da limitação. Isto ajuda-o a saber se a enzima está trabalhando corretamente e você configura a reação bem. Use um ADN do plasmídeo que gere testes padrões conhecidos da fragmentação.
• Ao preparar sumários dobro da enzima, determine o índice de sal dos amortecedores. Conduza a digestão da limitação usando a enzima com as exigências mais baixas de sal PRIMEIRAMENTE, a seguir use a segunda enzima ajustando o amortecedor do tubo da reação à segunda concentração óptima de sal.
• As preparações do ADN podem ter as impurezas que podem inibir a atividade da digestão da enzima da limitação. Alguns jogos da isolação do ADN mesmo usam amortecedores elevados do EDTA para elute o ADN. Isto é aprovado para o armazenamento do ADN, mas as concentrações elevadas do EDTA podem inibir a digestão da limitação. O PCR purify seu ADN e elute com TE ou molha-o se sua atividade de enzima é inibida mas seus olhares do ADN está bem. Você poderia igualmente adicionar Mg2+ à reação e ver se esse ajudas também.
• Se você não pode obter a digestão completa da limitação de seu ADN após ter adicionado a enzima extra, setup um sumário novo e adicione o spermidine a uma concentração final de 2 milímetros.

Digestão da enzima da limitação do ADN

Analítico contra digestões Preparative da enzima da limitação

As digestões do ADN são conduzidas geralmente em ul 25 - 50 (microlitros), quando você apenas quer verific ou analisar seu ADN. Estes são chamados digestões analíticas da enzima da limitação.

Um pode digerir 0.25 a 2 ug (microgramas) para preparações analíticas. Isto é porque em um minigel do agarose (30ml), se pode visualizar aproximadamente .05ug (50 ng, nanograms) por a faixa. O visualização de uma faixa depende do comprimento do ADN e da quantidade de presente do ADN. Geralmente, mais longo o ADN atual na faixa, o mais fácil é será ver.

Digestões do ADN de muitos microgramas e volumes mais elevados de 50 - o ul 500 (microlitros) ou mais são preparative, significando que você está preparando fragmentos do ADN para a purificação subseqüente e os está clonando.

Digestão da limitação do protocolo do ADN

Receita para a digestão da enzima da limitação:

Analítico

Você pôde adicionar Mg2+ à reação da digestão (sob a forma de MgCl) se você usa um grande volume de ADN. Você deve fazer este especial se o amortecedor você eluted seu ADN no EDTA contido. Isto é porque se “X” é grande, IE > 20ul o volume, você pode precisar de adicionar o magnésio. O EDTA liga a 4 toupeiras do magnésio para cada toupeira do EDTA. Assim, o ADN em uma solução (milimolar) de 1 milímetro do EDTA ligará 4mM do magnésio. Uma boa regra empírica é adicionar 1 1ul de 10mM MgCl a cada 20ul do ADN.

Preparative

Incube em 37°C por 1 - 3 horas.

1 unidade é bastante enzima ao ADN do ug digest1 pelo menos em 1 hora. Digerir por 3 horas você poderia digerir umas quantidades mais elevadas de ADN. Porque você está adicionando 10-20 unidades de enzima, você poderia mesmo digerir 10ug do ADN em 1 hora! As enzimas são caras não os desperdiçam supèrflua!

Notas no uso da enzima da limitação:

• Mantenha enzimas frias.
• Mantenha sempre enzimas da limitação no gelo!
• Minimize o tempo onde você tem enzimas da limitação no gelo. Você pode fazer este facilmente comprando uma caixa fria (que é basicamente um bloco de metal que você mantem suas enzimas dentro)

Referências:

Sambrook, J., Fritsch, E.F., e T. Maniatis. (1989) Clonagem molecular, um manual do laboratório. Segunda edição. Imprensa fria do laboratório do porto da mola. pp 5.3 - 5.32.

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