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Protocolo Da Isolação do Dna De Genomic

Selecionando um método do purification do DNA de Genomic

O objetivo da isolação genomic do DNA depende de que as aplicações do DNA após a isolação. O purity, a fonte, a quantidade e a qualidade do DNA são todas as edições que necessitam ser dirigidas antes da extração genomic do DNA. Um anfitrião inteiro de métodos diferentes, as tecnologias e os jogos estão disponíveis agora aos investigadores para isolar o DNA genomic das pilhas.

• A quantidade do DNA necessitou
• Peso molecular e tamanho do DNA
• O purity do DNA requereu
• Aplicações downstream do DNA
• Tempo disponível
• Facilidade da técnica ou do método da extração do DNA
• Despesa ou dinheiro disponível

Os métodos específicos home-grown ou do laboratório do DNA da extração frequentemente completamente bem para os laboratórios que os desenvolveram e usam regularmente estes protocolos.

Anote entretanto a estandardização da falta destes métodos. Também o rendimento do DNA e a qualidade do DNA não são sempre reproducible de uma pessoa ao seguinte.

Fundo na isolação e no purification do DNA de Genomic

Geralmente, todos os métodos envolvem o rompimento e o lysis das pilhas. Isto é seguido às vezes pela remoção do RNA (por RNAses, por sal ou por outros métodos). Escolhendo que método se usar dependerá de muitos fatores da seleção including:

O DNA é isolado das proteínas por diversos métodos including a digestão das proteínas pelo proteinase K. Proteína do enzyme é removido subseqüentemente o salting-out, a extração orgânica, ou ligar do DNA a uma sustentação solid-phase (tal como uma tecnologia da coluna ou do silicone do anion-exchange).

O DNA é recuperado finalmente pela precipitação do ethanol ou pela precipitação do isopropanol.

No general, a separação do DNA das pilhas e os componentes celulares podem ser divididos em quatro estágios:

1. Rompimento da pilha
2. Lysis da pilha
3. Remoção das proteínas e dos contaminadores
4. Recuperação do DNA

Em alguns protocolos genomic da isolação do DNA, os estágios 1 e 2 são combinados.

Os materiais necessitaram para o método da extração do DNA de Genomic

Amortecedor do lysis para a receita do DNA de Genomic:

50 milímetros Tris-HCl, pH 8.0
EDTA de 50mM
1% SDS
NaCl de 10mM

Método do purification do DNA de Genomic das amostras do tecido

1. Selecione a amostra do tecido para usar-se. Certifique-se que a amostra corretamente está preparada e mantida no gelo. Se a amostra não for usada imediatamente para a extração do DNA, então as amostras devem ser armazenadas corretamente no freezer de -20°C para um termo mais longo ou no 4°C para poucas horas) o uso curto do termo (.
2. Corte o tecido em partes menores. Para o fígado ou o outro tecido macio, não se preocupe sobre fazer partes finas.
3. Adicione o tecido (a um almofariz pre-cooled do gelo seco), adicione imediatamente o n2 do nitrogênio líquido.
4. Comece a moer o tecido no pó fino. Adicione mais Liq. N2 como necessitado. Transfira o pó frio ao tubo de 30 ml, licença destampada assim que o n2 pode evaporar.
5. Adicione 9 ml do amortecedor por-aquecido do lysis (5°C) e resuspend delicadamente o pó.
6. Adicione ul 100 de 10mg/ml do proteinase K, (isto é, 100 ug na solução). Incubate 55°C 1-18 horas. Misture delicadamente periòdicamente. Adicione ul 100 do proteinase K após primeiras 2 horas, optimum: 3 horas que adicionam o proteinase K em 1.5 hora.
7. Amostra do deleite muito delicadamente. Adicione 1 ml de 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml do phenol (55°C) morno, misture-o delicadamente mas throughly por 5-10 minutos.
8. Centrifuge amostras por 15 minutos.
9. Repita a extração morna do phenol.
10. Extrato com o phenol igual do volume (10ml): Cia (peça CIA de 1 porção phenol:1: Cia = 23 de chloroform:1 porções do álcool isoamyl da peça)
11. Extrato com extração igual do CIA do volume (10ml)
12. A fase superior deve estar relativamente desobstruída, se contiver cunhas brancas grandes, ou é muito leitosa, (i) incubate em 68°C 15 min., e em extrato do re-re-phenol, (ii) começo outra vez, mas incubate mais por muito tempo com P-K.
13. Fase superior de transferência ao tubo novo. Adicione 2 volumes do ethanol frio e misture-os delicadamente (sal: Na0Ac está já na solução). Usando um gancho e um pasteur selado introduza com pipeta o carretel para fora do DNA. Limpe fora o ethanol adicional no lado dos tubos. Resuspend em 2-5 mls de TE. Certifique-se que o DNA está dissolvido completamente (licença no shaker delicado.)
14. Adicione a mistura do rNase (100 ug do rNase A, 10U de RNaseT1). Incubate 30 37°C mínimos. ** você poderia adicionar o rNase antes do proteinase K, incubate em 37°C para 1 hora e começa então a digestão do proteinase. Você poderia então saltar etapa 15 -.
15. Adicione 100 ug do proteinase K, incubae 37°C 30 minutos.
16. Adicione 1/10 de vol. 3M Na0Ac, extrato do phenol uma vez, extrato de Phenol:CIA duas vezes, extrato do CIA uma vez.
17. Adicione 2.5 volumes EtOH, ponha-os em -20°C 30 minutos. Centrifuge 20 minutos.
18. Lave bem com 70%, remova todo o EtOH. Se você secar, não o excesso SECO.
19. Resuspend com cuidado, lentamente in1-2mls TE (amortecedor do Tris-tris-EDTA). (1x ou 0.1x).

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