Protocolo da isolação do ADN de Genomic

Selecionando um método da purificação do ADN de Genomic

O objetivo da isolação genomic do ADN depende de que as aplicações do ADN após a isolação. A pureza, a fonte, a quantidade e a qualidade do ADN são todas as edições que precisam de ser endereçadas antes da extração genomic do ADN. Um anfitrião inteiro de métodos diferentes, as tecnologias e os jogos estão disponíveis agora aos investigadores para isolar o ADN genomic das pilhas.

Quantidade de ADN necessário
Peso molecular e tamanho do ADN
A pureza do ADN exigiu
Aplicações a jusante do ADN
Tempo disponível
Facilidade da técnica ou do método da extração do ADN
Despesa ou dinheiro disponível

Os métodos específicos Home-grown ou do laboratório do ADN da extração frequentemente completamente bem para os laboratórios que os desenvolveram e usam regularmente estes protocolos.

Anote entretanto a estandardização da falta destes métodos. Igualmente o rendimento do ADN e a qualidade do ADN não são sempre reprodutíveis de uma pessoa ao seguinte.

Fundo na isolação e na purificação do ADN de Genomic

Geralmente, todos os métodos envolvem o rompimento e o lysis das pilhas. Isto é seguido às vezes pela remoção do RNA (por RNAses, por sal ou por outros métodos). Escolhendo que o método para se usar dependerá de incluir de muitos fatores da seleção:

O ADN é isolado das proteínas por diversos métodos que incluem a digestão das proteínas pelas proteínas da protease K. da enzima é removido subseqüentemente o salting-out, a extração orgânica, ou pela ligação do ADN a uma sustentação solid-phase (tal como uma tecnologia da coluna ou do silicone da troca aniónica).

O ADN é recuperado finalmente pela precipitação do álcool etílico ou pela precipitação do isopropanol.

Geralmente, a separação de ADN das pilhas e os componentes celulares podem ser divididos em quatro estágios:

Rompimento da pilha
Lysis da pilha
Remoção das proteínas e dos contaminadores
Recuperação do ADN

Em alguns protocolos genomic da isolação do ADN, os estágios 1 e 2 são combinados.

Materiais necessários para o método da extração do ADN de Genomic

Amortecedor do Lysis para a receita do ADN de Genomic:

Tris-HCl de 50 milímetros, pH 8.0
o EDTA de 50mM
1% SDS
NaCl de 10mM

Método da purificação do ADN de Genomic das amostras de tecido

Selecione a amostra de tecido para usar-se. Certifique-se que a amostra corretamente está preparada e mantida no gelo. Se a amostra não será usada imediatamente para a extração do ADN, a seguir as amostras devem ser armazenadas corretamente no congelador de -20°C para a longo prazo ou no 4°C para (o uso a curto prazo de poucas horas).
Corte o tecido em partes menores. Para o fígado ou o outro tecido macio, não se preocupe sobre a factura de partes finas.
Adicione o tecido (a um almofariz pre-cooled do gelo seco), adicione imediatamente o N2 do nitrogênio líquido.
Comece a mmoer o tecido no pó fino. Adicione mais Liq. N2 como necessário. Transfira o pó frio ao tubo de 30 ml, licença destampada assim que o N2 pode evaporar.
Adicione 9 ml do por-aquecido (5°C) o amortecedor do Lysis e resuspend delicadamente o pó.
Adicione ul 100 de 10mg/ml da protease K, (isto é, 100 ug na solução). Incube 55°C 1-18 horas. Misture delicadamente periòdicamente. Adicione ul 100 da protease K após primeiras 2 horas, situação óptima: 3 horas que adicionam a protease K em 1.5 horas.
Amostra do deleite muito delicadamente. Adicione 1 ml de 3M Na0Ac (pH 4.0), 10 ml de morno (55°C) o fenol, mistura delicadamente mas completamente por 5-10 minutos.
Centrifugue amostras por 15 minutos.
Repita a extração morna do fenol.
Extrato com o fenol igual do volume (10ml): CIA (fenol de 1 porção: 1 porção CIA: CIA= 23 porções do clorofórmio: 1 porção do álcool isoamyl)
Extrato com extração igual do volume (10ml) CIA
A fase superior deve ser relativamente desobstruída, se contem grandes cunhas brancas, ou é muito leitosa, (i) incuba em 68°C 15 Min., e em extrato do re-fenol, (ii) começo outra vez, mas incuba mais por muito tempo com PK.
Fase superior de transferência ao tubo novo. Adicione 2 volumes de álcool etílico frio e misture-os delicadamente (sal: Na0Ac está já na solução). Usando um gancho e um pasteur selado introduza com pipeta o ADN do carretel para fora. Limpe fora o álcool etílico adicional no lado dos tubos. Resuspend em 2-5 mls de TE. Certifique-se que o ADN está dissolvido completamente (licença no abanador delicado.)
Adicione a mistura do RNase (100 ug do RNase A, 10U de RNaseT1). Incube 30 37°C. mínimos ** você poderia adicionar o RNase antes da protease K, incuba em 37°C para 1 hora e começa então a digestão da protease. Você poderia então saltar etapa 15-.
Adicione 100 ug da protease K, incubae 37°C 30 minutos.
Adicione 1/10 de vol. 3M Na0Ac, extrato do fenol uma vez, fenol: Extrato do CIA duas vezes, extrato do CIA uma vez.
Adicione 2.5 volumes de EtOH, põr em -20°C o centrifugador de 30 Min. 20 Min.
Lave bem com 70%, remova todo o EtOH. Se você seca, não faça sobre SECO.
Resuspend com cuidado, lentamente in1-2mls TE (amortecedor do Tris-EDTA). (1x ou 0.1x).