Interações Assaying Da Proteína do Dna-

Aprenda sobre como assay interações da DNA-proteína.

Interações Assaying De DNAProtein

Há quatro técnicas importantes para assaying interações da DNA-proteína. As primeiras duas técnicas (emperramento do filtro e SHIFT da mobilidade do gel) determinam se seu DNA estiver interagindo com a proteína. Outras duas técnicas (dNase Footprinting e DMS Footprinting) indicam onde o local do alvo da interação entre a proteína e o DNA se encontra no DNA.

Emperramento Do Filtro

Os filtros da membrana do nitrocellulose são usados geralmente filter-sterilize soluções. Os filtros do nitrocellulose podem ligar o DNA, mas somente sob determinadas circunstâncias. O DNA de Singlestranded liga prontamente ao nitrocellulose, mas o DNA encalhado dobro por se não . Na outra mão a proteína liga, e se uma proteína for limitada ao DNA double-stranded o complexo proteína-Protein-DNA ligará. Consulte por favor a artigo obrigatório do assay do filtro do nitrocellulose para mais informação.

Gel A SHIFT Da Mobilidade

A fim medir interações da DNA-proteína esta técnica confia no fato simples que um DNA pequeno tem uma mobilidade muito mais elevada no electrophoresis do gel do que o mesmo DNA quando deve limitar a uma proteína. Nós podemos conseqüentemente etiquetar um fragmento encalhado dobro do DNA da sorte, a seguir misturamo-lo com uma proteína, e electrophorese o complexo. Então nós sujeitamos o gel no autoradiography para detectar a espécie etiquetada. O tamanho pequeno do DNA é importante neste assay. Se um gene inteiro fosse usado sua mobilidade seria já muito baixa, e a SHIFT da mobilidade causada pelo emperramento da proteína seria difícil de detectar. Conseqüentemente nós devemos saber aproximadamente onde a proteína liga ao DNA assim que nós podemos preparar um fragmento curto da limitação, ou mesmo um oligonucleotide double-stranded sintético que contenha o local do alvo para a proteína, mas pouco mais.

DNase Footprinting

Uma vez que nós sabemos que uma proteína liga a um DNA dado nós podemos usar footprinting para encontrar para fora onde o local do alvo se encontra no DNA. O dnase que footprinting confia no fato que uma proteína, ligando ao DNA, cobre o local obrigatório e assim que protege-o do ataque por Dnase. Neste sentido deixa uma "pegada" no DNA. A primeira etapa em uma experiência footprinting é extremidade-etiqueta o DNA. Nós podemos etiquetar uma ou outra costa, mas somente uma por a experiência. Em seguida, nós ligamos a proteína ao DNA. Então nós tratamos o complexo da DNA-proteína com o dnase I sob circunstâncias suaves (dnase muito pequeno), de modo que uma média de somente uma cortada ocorra por a molécula do DNA. Em seguida, nós removemos a proteína do DNA, separamos as costas do DNA, e electrophorese os fragmentos resultantes em um polyacylamide de alta resolução gel ao lado dos marcadores do tamanho. Os fragmentos levantar-se-ão da outra extremidade do DNA também, mas nós não os detectaremos porque são unlabeled. Nós incluímos sempre um controle com o DNA sozinho (nenhuma proteína), e usamos geralmente mais de uma concentração da proteína assim que nós podemos ver pelo disappearance gradual das faixas na região da pegada que a proteção do DNA depende da concentração da proteína adicionada. A pegada representa a região do DNA protegida pela proteína, e diz-nos conseqüentemente onde a proteína liga.

DMS Footprinting

O dnase que footprinting dá uma idéia boa da posição do local obrigatório para a proteína, mas o dnase é um macromolecule e é conseqüentemente um instrumento rather sem corte para sondar os detalhes finos do local obrigatório. Qual significa, aquela lá pode ser aberturas na interação entre a proteína e o DNA em que o dnase não caberia e conseqüentemente não detectaria. Além disso, as proteínas obrigatórias do DNA perturb freqüentemente o DNA dentro da região obrigatória, distorcendo a hélice dobro. Estes perturbations são interessantes, mas não são detectados geralmente por Dnase que footprinting porque a proteína mantem o dnase ausente. Para fazer footprinting mais detalhado, nós necessitamos uma molécula menor que possa caber nos nooks e nos crannies da DNA-proteína complexa e revelamos mais dos subtleties da interação. Uma ferramenta favorita para este trabalho é o dimethylsulfate methylating do agente (DMS).

Com o DMS que footprinting nós começamos fora na mesma maneira que no dnase que footprinting, extremidade-etiquetando o DNA e o emperramento a proteína. Então nós methylate o complexo da DNA-proteína com DMS, usando um tratamento suave de modo que na média somente um methylation ocorra mesmo por a molécula do DNA. Em seguida, nós desalojamos a proteína, e tratamos o DNA com um reagent que remova os purines methylated, criando os locais apurinic (deoxyriboses sem bases) no DNA. Então nós quebramos o DNA nestes locais apurinic. Estas reações são as mesmas que o DNA de Maxam-Gilbert que arranja em seqüência reações. Finalmente nós electrophorese os fragmentos e autoradiograph do DNA o gel para detectar o DNA etiquetado unimo-nos. Cada faixa termina ao lado de um nucleotide que methylated e assim desprotegido pela proteína.

Veja a molécula do DNA em 3-Dimensions

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