Interações de análise da proteína do ADN

Aprenda sobre como analisar interações da ADN-proteína.

Interações de análise de DNAProtein

Há quatro técnicas importantes para analisar interações da ADN-proteína. As primeiras duas técnicas (emperramento do filtro e SHIFT da mobilidade do gel) determinam se seu ADN está interagindo com a proteína. Outras duas técnicas (Footprinting do DNase e Footprinting do DMS) indicam onde o local do alvo da interação entre a proteína e o ADN se encontra no ADN.

Emperramento do filtro

Os filtros de membrana da nitrocelulose são de uso geral filter-sterilize soluções. Os filtros da nitrocelulose podem ligar o ADN, mas somente sob determinadas circunstâncias. O ADN Singlestranded liga prontamente à nitrocelulose, mas o ADN encalhado dobro por se não faz. De um lado a proteína liga, e se uma proteína é limitada ao ADN double-stranded o complexo proteína-ADN ligará. Refira por favor artigo obrigatório do ensaio do filtro da nitrocelulose para mais informação.

Coagule a SHIFT da mobilidade

A fim medir interações da ADN-proteína esta técnica confia no simples facto de que um ADN pequeno tem uma mobilidade muito mais elevada na electroforese do gel do que o mesmo ADN faz quando é limitar a uma proteína. Nós podemos conseqüentemente etiquetar um fragmento encalhado dobro do ADN da sorte, a seguir misturamo-lo com uma proteína, e electrophorese o complexo. Então nós sujeitamos o gel na autoradiografia para detectar a espécie etiquetada. O tamanho pequeno do ADN é importante neste ensaio. Se um gene inteiro foi usado sua mobilidade já seria muito baixa, e a SHIFT da mobilidade causada pelo emperramento da proteína seria difícil de detectar. Conseqüentemente nós devemos saber aproximadamente onde a proteína liga ao ADN assim que nós podemos preparar um fragmento curto da limitação, ou mesmo um oligonucleotide double-stranded sintético que contenha o local do alvo para a proteína, mas pouco mais.

Footprinting do DNase

Uma vez que nós sabemos que uma proteína liga a um ADN dado nós podemos usar o footprinting para encontrar onde o local do alvo se encontra no ADN. O footprinting do Dnase confia no fato de que uma proteína, ligando ao ADN, cobre o local obrigatório e assim que protege-o do ataque por Dnase. Neste sentido deixa uma “pegada” no ADN. A primeira etapa em uma experiência do footprinting é extremidade-etiqueta o ADN. Nós podemos etiquetar uma ou outra costa, mas somente uma por a experiência. Em seguida, nós ligamos a proteína ao ADN. Então nós tratamos o complexo da ADN-proteína com o Dnase mim sob circunstâncias suaves (Dnase muito pequeno), de modo que uma média de somente uma cortada ocorra por a molécula do ADN. Em seguida, nós removemos a proteína do ADN, separamos as costas do ADN, e electrophorese os fragmentos resultantes em um polyacylamide de alta resolução coagulam-se ao lado dos marcadores do tamanho. Os fragmentos elevararão da outra extremidade do ADN também, mas nós não os detectaremos porque são unlabeled. Nós incluímos sempre um controle com o ADN sozinho (nenhuma proteína), e usamos geralmente mais de uma concentração da proteína assim que nós podemos ver pelo desaparecimento gradual das faixas na região da pegada que a proteção do ADN depende da concentração da proteína adicionada. A pegada representa a região de ADN protegida pela proteína, e diz-nos conseqüentemente onde a proteína liga.

Footprinting do DMS

O footprinting do Dnase dá uma boa idéia da posição do local obrigatório para a proteína, mas o Dnase é uma macromolécula e é conseqüentemente um instrumento um pouco sem corte para sondar os detalhes finos do local obrigatório. Qual significa, aquela lá pode ser aberturas na interação entre a proteína e o ADN em que o Dnase não caberia e conseqüentemente não detectaria. Além disso, as proteínas obrigatórias do ADN perturb freqüentemente o ADN dentro da região obrigatória, distorcendo a hélice dobro. Estas perturbação são interessantes, mas não são detectadas geralmente pelo footprinting de Dnase porque a proteína mantem o Dnase ausente. Para fazer um footprinting mais detalhado, nós precisamos uma molécula menor que possa caber nas brechas e nos crannies da ADN-proteína complexa e revelamos mais das subtileza da interação. Uma ferramenta favorita para este trabalho é o dimethylsulfate de mistura com álcool metílico do agente (DMS).

Com footprinting do DMS nós partimos na mesma maneira que no footprinting do Dnase, extremidade-etiquetando o ADN e o emperramento a proteína. Então nós misturamos o complexo da ADN-proteína com DMS, usando um tratamento suave de modo que em média somente um methylation ocorra mesmo por a molécula do ADN. Em seguida, nós desalojamos a proteína, e tratamos o ADN com um reagente que remova as purina misturadas, criando os locais apurinic (deoxyriboses sem bases) no ADN. Então nós quebramos o ADN nestes locais apurinic. Estas reações são as mesmas que o ADN de Maxam-Gilbert que arranja em seqüência reações. Finalmente nós electrophorese os fragmentos e autoradiograph do ADN o gel para detectar o ADN etiquetado unimo-nos. Cada faixa termina ao lado de um nucleotide que seja misturado e assim desprotegido pela proteína.

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