Footprinting do ADN

Fundo no Footprinting do ADN

O footprinting do DNase é um método da biologia molecular que permita a deteção de interações da ADN-proteína explorando a propriedade que uma proteína que interage com o ADN protegerá o ADN nesse local da interação da digestão da limitação ou da segmentação enzymatic do DNAase. Um fragmento da limitação do ADN que contenha o local obrigatório específico é etiquetado em uma extremidade, geralmente com 32P e usado para o footprinting.

A proteína e o ADN são permitidos cruzar junto e ligar.

O footprinting do ADN utiliza o DNase da enzima nuclease mim ou do ácido deoxyribonucleic mim a fim digerir afastado ou cortar livre (ou etiquetado) ADN radiolabeled que sae a proteína de ADN encadernado protegido. Os fragmentos da limitação do ADN são tratados levemente com o DNase mim, que faz rupturas single-strand (entalhes) no ADN. Uma pequena quantidade de enzima é usada tais que há uma média de menos de 1 entalhe/costa. A reação é parada então, o ADN é desnaturado, e a mistura é funcionada em um polyacrylamide de desnaturalização que arranja em seqüência o gel. Estes fragmentos separaram pela electroforese do gel são expor para detectar a área protegida do ADN analisando o teste padrão da segmentação da borda no gel.

O teste padrão da segmentação do ADN na ausência de uma proteína obrigatória do ADN, referida tipicamente como o ADN livre, é comparado ao teste padrão da segmentação do ADN na presença de uma proteína obrigatória do ADN. Se a proteína liga o ADN, o local obrigatório está protegido da segmentação enzymatic. Esta proteção conduzirá a uma área desobstruída no gel que é referido como a “pegada”.

Variando a concentração da proteína ADN-obrigatória, a afinidade obrigatória da proteína pode ser estimada de acordo com a concentração mínima de proteína em que uma pegada é observada.

Receitas do amortecedor do Footprinting do DNAse

Receita obrigatória do amortecedor do Footprinting do DNase

2X sem o KCl/para 10mls:

uma quantidade: [final]
Tris-HCl pH7.6: ul 500 de 1M: 50 milímetros
MgCl2: 125ul de 1M: 12.5mM
O EDTA: ul 2 de 0.5M: 1mM
Glicerol: 2 mls: 20%
DTT: ul 10 de 1M: 1 milímetro

Amortecedor obrigatório (amortecedor da SHIFT do gel)

5X sem o KCL
[final]: ingrediente
20%: gylerol
5mM: MgCl2
2.5mM: O EDTA
2.5mM: DTT
250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5
0.25mg/ml: (dI-C.C.) poli poli (dI-C.C.)

Amortecedor de Ca/Mg

Para 10mls
CaCl2: ul 50 de 1M: 5 milímetros
MgCl2: ul 100 de 1M: 10 milímetros

Solução do carregamento
0.1 M: NaOH: formamid (1: 2 v/v)
0.1%: cyanol do xylene
0.1%: azul do bromofenol

Pare o amortecedor
10mls
NaCl: ul 400 de 5M: 200 milímetros
O EDTA: ul 600 de 0.5M: 30 milímetros
SDS: 1 10%:1% do ml

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.)
Tris-HCl, ul do 7.6:500 do pH de 1 M: 50 milímetros
O EDTA: 2ul de 0.5 M: 1 milímetro
Beta-mercaptoethanol: ul 10: 15mM

amortecedor de 10 x K
para 1 ml
Ul do 7.5:100 do pH Tris-HCl de 1 M: 100 milímetros
MgCl2: ul 100 de 1 M: 100mM
DTT: ul 50 de 1M: 50 milímetros
dH2O: ul 750

Protocolo do Footprinting do DNAse

O ADN usado contem geralmente o local obrigatório de sua proteína do interesse. O ADN purified, a seguir é digerido com fragmentos da limitação para ser de um tamanho do appopriate. O fragmento do ADN é etiquetado em uma extremidade (local obrigatório > 25 bp da extremidade).

Uma rotulagem da costa pode accomplised perto:

isolando o fragmento com as enzimas da limitação que contêm ' saliência 5, etiquetando com Klenow e o nucleotide quente apropriado. Então sumário com uma enzima que remova uma extremidade.
isolar um fragmento digerido com uma enzima da limitação que crie 5 ' e a saliência os 3 ' termine, etiquetando com Klenow etiquetará somente 5 '.
Como em “a” mas com alguma enzima e utilização da quinase de polinucleotido para etiquetar ' extremidade 3 (quinase) e digestão fora de uma das extremidades com uma segunda (terceira) enzima da limitação.
(LEMBRETE: se etiquetando com Klenow, no fim da reação adicione um excesso de nucleotide frio do mesmo nucleotide que é etiquetado (isto é se você usa dCTP32, adicione o dCTP na extremidade) para se certificar de todas as extremidades é preenchido ingualmente.

Para fragmentos de Klenow, 0.3ug trazem ul até 100 em TE, matança Klenow do calor no °C 68 por 10 minutos.

ROTULAGEM com ' saliência um 5

Amostra RXN: 15 ng são necessidade para cada reação. Se fazendo a ponta de prova para muitas reações APENAS aumente uma quantidade de ADN até 300 ngs.
15ng: Fragmento do ADN
ul 2: amortecedor de 10x K
ul 5: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul
ul 2: 2mM @ a Dinamarca, dTTP do dG
1 ul: Klenow
20 volumes finais do ul, 37°C 30 Min.
--adicione 1 dNTP do ul 10mM, 5 minuto @ 37°C.

--adicione 80 ul TE. 68°C 15 minutos, põr sobre o gelo.
--Coluna da rotação G-50 (rotação aproximadamente em 2000g)
--ADICIONE 1/10 de vol 3M Na0Ac, 2.5 volumes de EtOH, congele 30 minutos, (opcional se [ADN] é = ou > 3 ng/ul você pôde afixar G-50 diretamente) Microfuge 30 minutos.
--lave com 70%
--Seco traga acima em 5ul

Reação obrigatória para o Footprinting do DNase

A reação obrigatória deve ter entre o KCl de 10 e de 150mM (mais sal se reduz ligar mas especificidade dos aumentos). A concentração típica é 50mM.

Emperramento do ADN da proteína:
ul 25 do amortecedor 2X obrigatório sem o KCl
5ul do ADN unilabeled 3 ng/ul
Ul X do KCl para igualar 10-150 milímetros de KCl
dH20 para igualar ul 50 menos o volume para ligar protien
1-3 unidades do Footprinting de proteína obrigatória do ADN (ou 10 a 160 ug do extrato nuclear cru)

--a mistura delicadamente, congela 10 minutos.

SINCRONISMO DO SUSTENTO NA MENTE,
--ADICIONE ul 50 da solução do RT Ca/Mg, 18°C para 1 minuto.
--ADICIONE ul que 3 o DNase RQ1 diluído (0.05 u/ul diluídos em Tris) INCUBA 1 minuto.
--PARE uma adição de 90 com soluções do BATENTE 37°C,

--você deve fenol: Extrato do CIA, e do CIA, e precipitate do álcool etílico.
--RESUSPEND em 4ul da solução do carregamento.
--Funcione em Urea-ADN padrão de 5% que arranja em seqüência o gel (considere o gel da cunha) com as pistas do carregamento do appopriate tais como a escada do ADN, ADN uncut, e controles.

Analise o teste padrão do footprinting.