Protocolo bacteriano da isolação do ADN de Genomic

Isolação do ADN de Genomic do protocolo de Bateria

Método da preparação para a isolação do ADN geneomic das bactérias usando a purificação de triton

• Cresça diversas colônias - grandes culturas de scale-15ml.
• Colha as pilhas em um único tubo do eppendorf ou em um tubo descartável de 15 ml dependendo do volume.
• Resuspend a pelota com amortecedor de 300ul STET (900ul).
• Após resuspending adicione a mistura do RNase 30ul/lysozyme (100ul).
• Ferva a pelota para 1 minuto 15 segundos (um minuto 45 segundos).
• Gire no microfuge por 15 minutos.
• Tome o extrato do supernatant e do fenol com (500ul) o fenol 150ul saturado STET-.
• Gire e tome o supernatant. Adicione o cloreto do lítio de 1/10 de volume 4M (esterilizado). Deixe para sentar-se no gelo por 5-10 minutos.
• Gire e tome o supernatant. Adicione o isopropanol igual do volume. RT por 5 minutos.
• Rotação. Nenhuma pelota será visível. Não se apavora, o ADN é furado para tomar o partido toda a maneira acima do tubo.
• Importante: Lavagem com álcool etílico de 80% (95% fará com que o resíduo Triton precipite)
• Resuspend a pelota em 50-200ul.
• Loja Tris-HCl pH8.0 do RNase do lysozyme 1mg/ml da mistura 10mg/ml do RNase do Lysozyme/(classe barata do uso (BMB) um pouco do que o RNase A, que é demasiado caro) 50mM em -20oC em partes alíquota pequenas. Não refreeze após thawing.
• O filtro do pH 8.0 do EDTA do Tris-HCl da sacarina 5% Triton X-100 50mM de STET 8% (pH8.0) 50mM sterilize. Loja em 4oC