Cloning do Dna

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Cloning Antarctic do Dna Do Phosphatase dnamolecule	03-24-2008 02:03 PM por JO18 "	1	353
Colônias Brancas Azuis Do Positivo Da Seleção Do Cloning liono	02-20-2008 08:45 AM por Priyanka "	1	588
Dna Sem corte Do Cloning Da Extremidade pipette_man	01-23-2008 04:17 AM pelo postdock "	2	450
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Eu estou procurando um doutor ou qualquer um que saibam qualquer coisa sobre o cloning!!! Rocky89	06-04-2008 12:46 AM por Rocky89 "	5	91
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Nenhumas Colônias Que Cloning Pilhas Competentes Do Vetor princezz	01-24-2008 03:27 PM pelo princezz "	2	253
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Cloning de PCR e de Topo kiki06	12-05-2006 09:49 PM por kiki06 "	2	1283
problema com sumário de cloning/restriction shurgood	01-24-2008 10:15 PM pelo shurgood "	0	368

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Inserções cloning em plasmids

Protocolo Do Cloning do Dna

Para clone o necessite o seguinte:

Vector o DNA ou a sua construção do plasmid

O DNA do vetor pode ser:
Dna do vetor ou do plasmid (que necessita ser

Para clone o necessite ao menos diversos microgramas (3-5 ou mais) de seu DNA do vetor.

Introduza DNA (DNA que você quer introduzir no plasmid ou no vetor)

O DNA da inserção pode ser:
Inserção do oligonucleotide (oligos com os metade-locais do corte da limitação recozidos e phosphorylated com PNK)
Inserção Gerada Enzyme Da Limitação
Inserção de PCR (PCR com os locais do corte do enzyme da limitação (o local inteiro é needed!) na extremidade’ 5 do primer)

Se a inserção que você quer clone for menos de 60 bp, você pode requisitar oligonucleotides e recozê-los junto.

Se seu tamanho do DNA da inserção for pequeno (menos bp de 1000), você não necessita teòrica tanto DNA quanto seu vetor. Se seu tamanho do DNA da inserção for minúsculo (10-200 bp), você necessita muito pouco deste DNA teòrica.

No general você deve ter ao menos 1 micrograma de começar o DNA da inserção.

Preparando o DNA do vetor para o cloning: Mini-preparação, Midi-preparação, Maxi-preparação

Nós encontramos que a maneira a mais fácil preparar o DNA está usando um jogo mini-preparação (Qiagen). Nós usamos diversas colunas para a mesma construção do DNA do vetor.

Para cada coluna nós adicionamos aproximadamente 4 mL das bactérias crescidas libra (nós adicionamos 2 mL do caldo de carne das bactérias da libra a um tubo do eppendorf de 2 mL e giramos duas vezes = 2 x 2 mL = 4 mL)

Ponta: Cresça sempre aproximadamente 5 mL da libra nos tubos do falcão de 15 mL, mantêm o 1 mL como as bactérias de um glycerol estocam frozen – no freezer de 80 C.

Como fazer a um glycerol o estoque bacteriano para – o freezer de 80 C que se manterá por anos (você nunca terá que listar placas ou fazer outra vez pilhas competentes! – conserva-o tempo)

Adicione simplesmente o glycerol de 50% a seu crescimento bacteriano libra. Este não tem que ser IE exato se você for deixado com o aproximadamente 1 mL da libra bacteriana adicionar aproximadamente 500 uL do glycerol 100% e se congelar – nos 80 C.

Após eluting cada coluna com aproximadamente 50 uL do EB (o amortecedor do elution, Qiagen, amortecedor de Tris – não contem o EDTA), nós pool os eluates tais que nós temos ao redor 200 uL a 400 uL (ou a 4 – 8 colunas por a construção ou o vetor). Isto é dá bastante DNA começando do vetor para o cloning.

Nota: nós encontramos que o EDTA em TE inibe a digestão subseqüente da limitação do DNA eluted de mini-preparação e de outros jogos do purification do plasmid.

Preparando o DNA da inserção para o cloning

Introduza o DNA deve ser

Digestão e corte do enzyme da limitação seu vetor do plasmid para o cloning do DNA

O vetor do plasmid é cortado geralmente.

Ligation da inserção e do vetor

Para ligate a inserção para vector, use 200 ng do vetor como uma guia (os povos usam tão pouco quanto 50 o manual – do ng N.E.B).

Introduza ng = ng do vetor
Introduza o tamanho do vetor do tamanho

Conseqüentemente para ligate uma inserção de 500 bp em um vetor que de 5000 bp você necessitaria

Introduza ng = 200 ng X 500
5000

Introduza ng = 20 ng da inserção necessitados para um 1: 1 ligation

Para uma inserção 3: 1 ligation que do vetor você necessitaria: 60 ng

Ligation

Vetor do DNA    dos uL X 200 ng
Inserção dos uL     de Y (ng calculado)
2 amortecedor dos uL 10 X
1 ligase NEB do DNA dos uL T4
a 20 uL     H20

total de 20   uL

Faça exame de 5 uL do ligation e adicione-os a 100 uL de pilhas Invitrogen do alfa do AO 5
(aprovação da eficiência de Subcloning, um disparado mais melhor, eficiência melhor para – ligations duros mas caro máximos).

Aqueça Choque
Adicione 250 uL do SOC às pilhas competentes

Chapeie uma quantidade INTEIRA na placa.

Cresça o overnite em 37 C

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Especifique: Tamanho do vetor: bp
Especifique: Tamanho da inserção: bp
Relação: (toupeiras do DNA da inserção por a toupeira do DNA do vetor)

Para o ng do DNA do vetor, adiciona ng do DNA da inserção.

Bioinformatics, Protocolos, Proteína Proteomics do RNA do Dna

Estações Intracellular