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Pilha Transfection

Este local de Transfection é seu portal para todas as coisas relacionadas ao transfection das pilhas com plasmid ou vetor do DNA, do RNA se siRNA ou RNAi, ou mesmo da proteína recombinant. Nós fornecemo-lo com toda a informação de fundo, protocolos para o transfection da pilha, etapas do optimization e da análise, e informação de pesquisa de defeitos do transfection da pilha para transformar-se o perito final!

Índice de Transfection

• Que é transfection?
• Fundo
• Aplicações
• Materiais
• Métodos De Transfection
• Amortecedores
  
• Preparação
• Protocolo
• Outros protocolosdo ransfection de T
• Tópicos da discussão para Transfection
• Comece a ajuda em seus problemas de Transfection
• Pontas
• Armazenar
• Pesquisa de defeitos Em Transfection
• Referências

Que é Transfection?

Transfection descreve a introdução do material extrangeiro em pilhas eukaryotic usando um vetor do vírus ou outros meios de transferência.

 

O transfection do termo para métodos non-non-viral está usado o mais frequentemente na referência às pilhas mammalian, quando a transformação do termo for preferida descrever transferência non-non-viral do DNA nas bactérias e em pilhas eukaryotic do non-animal tais como fungos, algas e plantas.

Transfection das pilhas animais envolve tipicamente abrir pores ou ' furos transientes na membrana do plasma da pilha, para permitir o uptake do material. O material genetic (como supercoiled construções do DNA ou do siRNA do plasmid), ou mesmo as proteínas tais como antibodies, podem ser transfected. Além ao electroporation, o transfection pode ser realizado misturando um lipid cationic com o material para produzir os liposomes, que fundem com a membrana do plasma da pilha e depositam sua carga para dentro.

O meaning original do transfection era ' infecção pela transformação ', isto é introdução do DNA (ou do RNA) de um vírus ou de um bacteriófago do eukaryote em pilhas, tendo por resultado uma infecção. Porque a transformação do termo teve um outro sentido na biologia animal da pilha (uma mudança genetic permitindo a propagação a longo prazo na cultura, ou na aquisição das propriedades típicas de pilhas de cancer), o transfection do termo adquiriu, para as pilhas animais, seu meaning atual de uma mudança nas propriedades da pilha causadas pela introdução do DNA.

Transfection é um método por que o DNA experimental pode ser posto em uma pilha mammalian cultivada. Tais experiências geralmente são executadas usando o DNA cloned que contem seqüências de coding e controlam as regiões (promoters, etc.) a fim testar se o DNA estará expressado. Desde que o DNA cloned pode extensivamente ter sido modificado (para o exemplo, os locais obrigatórios da proteína no promoter podem ter sido alterados ou removido), o transfection é usado frequentemente testar se uma modificação particular afeta a função de um gene.

Diagrama De Transfection:

Aplicações De Transfection

A abilidade synthesize o RNA no laboratório é crítica a muitas técnicas. As pontas de prova radiolabeled e non-non-radiolabeled do RNA são requeridas para muitos protocolos, e podem synthesized fàcilmente na escala pequena em reações da transcrição de vitro permitindo seu uso em hybridizations do borrão e em assays da proteção do nuclease.

 

Exigências para Transfection?

• Vetor ou DNA
• Pilhas
• Reagent De Transfection

Transfection Optimizing

Em vitro a transcrição requer um molde linear purified do DNA que contem um promoter, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

Que reagent de Transfection a se usar?

Em vitro a transcrição requer um molde linear purified do DNA que contem um promoter, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

Métodos De Transfection

Há uns vários métodos de introduzir o DNA extrangeiro em uma pilha eukaryotic. Muitos materiais foram usados como portadores para o transfection, que pode ser dividido em três tipos: polímeros, liposomes e nanoparticles (cationic).

Um (e menos de confiança) dos métodos os mais baratos é transfection pelo phosphate de cálcio, descoberto originalmente por F. L. Graham e por A. J. camionete der Eb em 1973[citation necessitado ] (veja também [ 1 ]). a solução saline HEPES-protegida (HeBS) que contem íons do phosphate é combinada com uma solução do cloreto de cálcio que contem o DNA para ser transfected. Quando os dois são combinados, um precipitate fino do cálcio positivamente carregado e do phosphate negativamente carregado dará forma, ligando o DNA para ser transfected em sua superfície. A suspensão do precipitate é adicionada então às pilhas para ser transfected (geralmente uma cultura de pilha crescida em um monolayer). Por um processo compreendido não inteiramente, as pilhas fazem exame acima de algum do precipitate, e com ele, o DNA.

Outros métodos usam compostos orgânicos altamente ramificados, dendrimers so-called, ligar o DNA e começá-lo na pilha. Um método muito eficiente é o inclusion do DNA a ser transfected nos liposomes, isto é os corpos pequenos, membrana-limitados que estão em algumas maneiras similares à estrutura de uma pilha e podem realmente fundir com a membrana da pilha, liberando o DNA na pilha. Para pilhas eukaryotic, o lipid-lipid-cation baseado transfection é usado mais tipicamente, porque as pilhas são mais sensíveis.

Um outro método é o uso de polímeros cationic tais como o DEAE-dEAE-dextran ou o polyethylenimine. O DNA negativamente carregado liga ao polycation e o complexo é feito exame acima pela pilha através do endocytosis.

Uma aproximação direta ao transfection é o injetor do gene, onde o DNA é acoplado a um nanoparticle de um sólido inerte (geralmente ouro) que "seja disparado então" diretamente no núcleo da pilha do alvo. O DNA pode também ser introduzido em pilhas usando vírus como um portador. Nesses casos, a técnica é chamada transduction viral, e, as pilhas seriam transduced.

Outros métodos do transfection incluem o nucleofection, o electroporation, o choque do calor, o magnetofection e reagents proprietários do transfection tais como Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene ou DreamFect.

 

Estábulo contra métodos transientes de Transfection

Para a maioria de aplicações do transfection, é suficiente se transfected o gene for expressado somente transiente. Desde que o DNA introduzido no processo do transfection não é introduzido geralmente no genome nuclear, o DNA extrangeiro está perdido no estágio mais atrasado quando as pilhas se submetem ao mitosis. Se for que transfected gene desejado remanescer realmente no genome da pilha e suas pilhas da filha, um transfection estável deverem ocorrer.

Para realizar este, um outro gene é o co-transfected-transfected, que dá à pilha alguma vantagem da seleção, tal como a resistência para um determinado toxin. Algum (muito poucos) do transfected pilhas, terá introduzido por acaso o material genetic extrangeiro em seu genome. Se o toxin, para que o gene co-transfected-transfected oferece a resistência, for adicionado então à cultura de pilha, only aquelas poucas pilhas com os genes extrangeiros introduzidos em seu genome poderão proliferate, quando outras pilhas morrerão. Após ter aplicado esta pressão da seleção por alguma hora, somente as pilhas com um transfection estável remanescem e podem ser cultivadas mais mais.

Um agente comum para o transfection estável é Geneticin, sabido também como G418, que é um toxin que possa ser neutralizado pelo produto do gene resistente do neomycin.

 

 

Que reagent ou método de Transfection a se usar?

Em vitro a transcrição requer um molde linear purified do DNA que contem um promoter, triphosphates do ribonucleotide, um sistema do amortecedor que inclua DTT e magnésio

 

Pontas para Transfection

• Use inibidores do rNAse sempre!
• Dinheiro do saving com o polymerase phage do RNA T7: Clones com um Tag do N-terminal His-6 estão disponível. Se você obtiver este clone, você pode purify quantidades grandes do polymerase T7 com atividade elevada (referência: Ele B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, PESO De McAllister, Durbin RK. Proteína Expr Purif. 1997, 9, 142–151).
• Para remover o molde do DNA, use um dNAse RNAse-livre. Nós usamos o dNase RQ1 (Promega) adicionado por 15 minutos e trabalha bem. 

Armazenando O Reagent De Trasfection

• O RNA é armazenado melhor em um pH neutro com EDTA.
• O amortecedor de TE é recomendado (10 do 1 milímetro EDTA do milímetro Tris-HCl, do pH 7.5), porém este deve ser preparado com o rNAse purified livre (preferablly água do millipore).

Problemas De Pesquisa de defeitos De Transfection

Transfections Falhado

As causas incluem:

• Reagent velho do transfection
• Agente impropriamente armazenado do transfection
• Dna da qualidade deficiente ou vetor
• Uma quantidade insuficiente do DNA
• Reagent insuficiente do transfection
• Demasiado DNA
• Demasiado reagent do transfection

Referências em Transfection

Referências em Transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). "transferência do gene para o kinase do thymidine às pilhas humanas kinase-kinase-deficient do thymidine pelo DNA viral simples purified do herpes". Proc Acad Natl Sci EUA 74 (4): 1590-4. PMID 193108.

 

 

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