Boa vinda à estação molecular!

Você tem que registar antes que você possa afixar em nossos forums ou usar nossas características avançadas. Registo Agora! Seus livre e rápido!

Registado já? Início de uma sessão agora abaixo.

Nome Do Usuário:

Senha:

Recorde-me?

Registado já e esqueceu-se de sua senha? Clique abaixo para recuperá-la.

Recupere Senha Perdida

Junte agora - está rápida e livre!

A estação molecular é a rede a maior dos investigadores, dos cientistas e dos amantes da ciência em qualquer lugar!

Bornes Recentes Do Forum

Local Do Bookmark Do Bookmark

Contaminação Do Mycoplasma & Cultura De Pilha

Nós incluímos aqui para laboratórios da cultura de pilha, informação em contaminações do mycoplasma e as discussões as mais atrasadas do forum do mycoplasma para todas suas perguntas e discussões da contaminação.

Fundo Do Mycoplasma

Mycoplasmas é um genus das bactérias que faltam uma parede de pilha. devido a uma falta de uma parede de pilha, são resistente a muitos antibióticos including o penicillin ou a outros antibióticos do beta-beta-lactam que alvejam a síntese da parede de pilha.

O mycoplasma é parasítico ou saprophytic. Diverso o mycoplasma doença-está causando nos seres humanos, including pneumoniae do M., que é uma causa importante do pneumonia atypical e de outros disorders respiratory, e genitalium do M., que é acreditado ser envolvido em doenças inflammatory pelvic. Podem causar ou contribuir a alguns cancers.

Genus Mycoplasma

O genus mycoplasma é um de diversos genera dentro da classe Mollicutes. Mollicutes é as bactérias que têm genomes pequenos, faltam uma parede de pilha e têm um GC-índice baixo (18-40 %).

Há sobre 100 espécies reconhecidas do genus mycoplasma. Seu tamanho do genome varia de 0.58 1.38 megabase-par. Mollicutes é parasites ou commensals dos seres humanos, dos animais (insetos including), e das plantas; o genus mycoplasma é pela definição restringida aos anfitriões vertebrate. O cholesterol é requerido para o crescimento da espécie do genus mycoplasma as.well.as determinados outros genera dos mollicutes. Sua temperatura a melhor do crescimento está frequentemente a uma temperatura de seu anfitrião se warmbodied (por exemplo 37 graus Célsio nos seres humanos) ou temperatura ambiental se o anfitrião for incapaz de regular sua própria temperatura interna. A análise de seqüências ribosomal do RNA 16S assim como o índice do gene sugere fortemente que os mollicutes, including os mycoplasmas, estão relacionados pròxima ao lactobacillus ou à filial do clostridium da árvore phylogenetic (stricto do sensu de Firmicutes).

Linhas e Mycoplasmas da pilha

Em culturas de pilha, os mycoplasmas podem induzir mudanças celulares, including aborations do chromosome, mudanças no metabolism e crescimento da pilha. As infecções severas do mycoplasma podem destruir uma linha da pilha ou render as linhas caras ou preciosas da pilha inúteis.

Contaminação da cultura de pilha com mycoplasma

Mycoplasmas é encontrado frequentemente em laboratórios de pesquisa como contaminadores na cultura de pilha. A contaminação mycoplasmal da cultura de pilha ocorre devido à contaminação dos indivíduos ou dos ingredientes contaminados do media de cultura da pilha.

Métodos De Deteção Do Mycoplasma

As pilhas do mycoplasma são geralmente menores de 1 µm e conseqüentemente completamente difíceis de detectar com métodos convencionais do microscopy. As técnicas da deteção incluem:

• PCR
• PCR Real-time
• Chapeamento no ágar sensível
• Manchas do DNA including DAPI ou ou mancha de Hoescht

Protocolo Da Deteção Da Contaminação Do Mycoplasma Da Mancha De Hoechst

Um Hoechst (sigma, catálogo #:H6024) manchando o método para o mycoplasma:

1. Para pilhas adherent, coloque um vidro sterile da tampa no prato de petri. Adicione 2-3 gotas da suspensão da pilha no meio dos coverglass (dependendo da taxa de crescimento de suas pilhas).
2. Então adicione com cuidado 2-3 ml do media sem perturbar as pilhas. Cresça as pilhas até que estejam 50 -70% confluent.

Pilhas Reparando:

1. Prepare o fixative da pilha que é um metanol do fo 3:1 da mistura: ácido acetic glacial (M:AA). Certifica-se você para preparar isto fresco antes do uso.
2. Rejeite o media das pilhas crescentes. Adicione 2 ml do metanol: solução glacial do ácido acetic M:AA dropwise no lado da placa (não diretamente nas pilhas). Roda a placa e rejeita a solução.
3. Adicione 2 ml de M:AA, rode e saa-os sobre por 2-3 minutos na temperatura de quarto.
4. Descarte M: Solução e enxaguadura do AA com água
5. Saa à concentração conservada em estoque seca da mancha de Hoecht do ar (você pode manter a placa até que você esteja pronto para manchar) (gato # 33258 do sigma) = 0.1 mg/ml na água que você pode filtrar sterilize neste estágio usando uns 0.2uM o recipiente do envoltório do filtro na loja da folha de alumínio na solução trabalhando de 4 oC prepara fresco cada vez como necessário faz a diluição de 1:1000 (0.1 µg/ml) do estoque na água

Manchando Pilhas:

1. Adicione bastante mancha de Hoechst para cobrir o deslizamento inteiro da tampa (uso 1-2ml para um prato de petri pequeno).
2. Deixe a mancha sobre por 45 minutos - 1 hora (na obscuridade).
3. Enxágüe bem com água.
4. Monte em uma corrediça do microscópio (mistura mountant: 22 milímetros de ácido citric; 55.6 milímetros de phosphate disodium; glycerol de 50%, mistura do pH 5.5) ao lugar uma gota ou dois no deslizamento da tampa (pilhas acima) e no deslizamento da tampa do lugar (pilhas para baixo) na corrediça.
5. Visualize sob o microscópio do fluorescence

Nota: armazene a mancha de Hoechst em 4oC ao menos, ou o aliquot no freezer para o armazenamento a longo prazo.