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Protocolo Da Isolação Do Protoplast

Preparação dos protoplasts metabolically competentes

Saji Menon e Vibha Tyagi
Instituto de Birla da pesquisa científica, círculo da estátua, Jaipur (Rajasthan), India

Materiais requeridos para a isolação do protoplast

• ethanol de 70%
• 0.1% Cloreto Mercuric
• mannitol de 0.5M

• Solução do enzyme:
• Cellulase 0.25% Macerozyme R-10 De 1%
• KH2PO4 de 27.2 mg/l
• 101 mg/l KNO3
• 1480 mg/l CaCl2.2H2O
• 246 mg/l MgSO4.7H2O
• mannitol de 0.5M (pH 5.6)

• Media De Lavagem Do Protoplast Da Pilha:
• mannitol de 0.5M (pH 5.6)
• KH2PO4 de 27.2 mg/l
• 101 mg/l KNO3
• 1480 mg/l CaCl2.2H2O
• 246 mg/l MgSO4.7H2O

• Media de cultura modificado do protoplast       

(a tabela é alistada abaixo)

Protocolo para a preparação dos protoplasts metabolically competentes

• Folhas frescas da tomada de 4-5 plantas aseptically crescentes velhas da semana.
• A superfície sterilize no ethanol de 70% seguido tratando com o 0.1% cloreto mercuric para 1 minuto.
• Lave as folhas completamente com água destilada sterile.
• Descasque o epidermis mais baixo do tecido da folha e coloque-o na solução do mannitol de 0.5M para uma hora em um petriplate.
• Remova a solução do mannitol e substitua-a com a solução sterilized filtro do enzyme.
• Incubate as placas na obscuridade por 16-20 horas em 25oC.
• Separe a camada do protoplast pelo filtration usando a membrana do nylon de 0.45µM.
• Centrifuge o filtrate em 1000g por 10 minutos no oC 4.
• Remova o supernatant e resuspend a pelota no media de lavagem do protoplast da pilha.
• Centrifuge em 1000g por 10 minutos.
• Repita etapa 9 duas vezes.
• Suspenda finalmente a pelota do protoplast em uma densidade de 1*105 ml/l no media de cultura modificado do protoplast.
• Chapeie os protoplasts como muito bem mergulham finamente nos petriplates.
• Incubate as placas no oC 25 na obscuridade.

Media De Cultura Modificado Do Protoplast