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Antibodies De Polyclonal

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Protocolos do antibody de Polyclonal:

Antibody De Polyclonal

 

Os antibodies de Polyclonal são antibodies derivados de muitas B-pilhas ou linhas da B-pilha, similares à mistura dos antibodies encontrados em sera de sangue.

Os antibodies de Polyclonal são conseqüentemente uma mistura de muitos specificities diferentes do antibody.

As preparações do antibody de Polyclonal compradas são misturas dos antibodies de muitos specificities diferentes ao mesmo antígeno.

O immunization de um coelho, do rato, da cabra, da galinha, ou do outro animal produz antibodies do polyclonal. Os sera animais podem ser usados diretamente, porém é melhor purify antibodies do polyclonal para o uso do laboratório.

Preparação Do Antibody De Polyclonal

Baseado no protocolo pelo Dr. David Bowtell

Immunization dos ratos:

As injeções para immunize ratos para a geração de antibodies do polyclonal devem ser feitas em intervalos ao menos de duas semanas separadas.

Os seguintes 2 adjutores foram bem sucedidos:

  1. Para a primeira injeção do immunization: injete 15 - 50 ug se antígeno no adjutor do ul 200, injetado subcutaneously.
  2. A segunda injeção deve ocorrer 2 semanas mais tarde; Você deve então impulsionar com 15 - 50 ug do antígeno no adjutor. (se o tempo permitir, impulsione outra vez um mês mais tarde).
  3. Sete a 10 dias sangra mais tarde o serum do rato e do teste usando o assay que será usado para a seleção. Se o titre não for altamente bastante, impulso outra vez duas semanas após o impulso precedente.

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Preparação Do Serum:

  1. Após a coleta, o sangue deve ser permitido clot por 60 minutos. em 37°C ou em O.N em 4°C.
  2. Separe o clot dos lados do tubo (soar) que usa uma pipeta do pasteur. Coloque o clot em 4°C O.N.
  3. Gire em 10000 x g por 10 min. em 4°C para separar o serum.
  4. O serum pode ser armazenado em -20°C após ter adicionado o glycerol a 50%.

Se monoclonal os antibodies estão desejados, uma vez que você manda um polyclonal "bom" e um método de seleção de confiança proseguir à etapa seguinte.

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Coelhos:

Os coelhos immunized essencialmente como descritos acima. Injeções:

  1. Primeiramente na injeção 100-200ug/1ml completa de Freund, dois locais (sobre cada ombro).
  2. Em segundo 1 mês mais tarde em Freund INCOMPLETO como acima.
  3. Sangramento 2 semanas mais tarde. Impulso 2 semanas mais tarde outra vez (ciclo de 2 + 2 semanas).

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PRODUÇÃO DE ANTIBODIES DE POLYCLONAL NOS COELHOS (BRANCO DE NEUSEELAND)

Baseado no protocolo por Dr.Walter Steffen.

Os coelhos devem ser 3-4 quilogramas no peso e nos aproximadamente 3 meses velho. Sobre um third do coelho tenha antibodies e o immunoactivity endogenous do anti-anti-keratin para vário outros componentes celulares. Isto emfatiza a importância de fazer exame do serum pre-imune de todo o coelho dado.

Amortecedores e soluções:

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Obtendo O Serum:

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Precipitação do sulfate do ammonium de IgG do serum (oC 4, realizado no quarto frio):

A precipitação do sulfate do ammonium é um método fácil para obter uma fração razoavelmente pura de IgG.

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Immunization:

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Referências: Garvey, J.S., Cremer, Nordeste, & Sussdorf, AO (1977) Em: Métodos no immunology. Publicação. O Benjamin/Cummings Publishing Companhia. Massa Das Leituras. pp 545

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Seleção do antibody de Polyclonal usando o assay de ELISA

Protocolo de ELISA para a tela do antibody:

Materiais para ELISA:

placas do ° - 96 poço Dynatech Immulon, tipo 2. (fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% tween 20 ou TBS + 0.1% tween 20.

° que obstrui a solução = 2% BSA (tipo V) em PBS. (adicione 0.02% azide para um armazenamento mais longo.)

amortecedor de Elisa do ° = 2% BSA + 0.1% tween 20 em PBS (azide opcional).

antibody do ° = peroxidase ligados enzyme 1 do horseradish

carcaça do ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001)1

amortecedor do ° HRP: ácido citric do magnésio do pH 4.2(490 do citrato do Na de 100mM + citrato do Na do magnésio 720

dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2).

peroxide de hidrogênio 30% do ° (1000X)

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Protocolo de ELISA para o antibody de Polyclonal

1) ADSORBTION DO ANTÍGENO

a) AG diluído a 10 ug/ml em PBS.

b) Adicione ul 100 da solução do AG a cada um bem.

c) Deixe O.N coberto com o envoltório de saran, em 4°C.

2) OBSTRUÇÃO

a) O AG unbound da lavagem invertendo as placas e flicking os poços seca.

b) Enxaguadura adicionando PBS a cada um poço e invertendo o outra vez (o uso esguincha o frasco).

c) Repita a enxaguadura duas vezes.

d) Adicione ul 100 de obstruir a solução ao cada bem, deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

3) ANTIBODY PRELIMINAR

a) Adicione o antibody a ser testado:

Sup das pilhas = ul 25, mistura bem pipeting acima e para baixo (10 vezes).

serum, ascites = 1:100 e um serie de 1/5 das diluições. Faça diluições em obstruir a solução.

b) Deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

4) ANTIBODY SECUNDÁRIO

a) Antibody unbound da lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% tween 20.

b) Adicione ul 100 do antibody ligado enzyme a todos os poços. Faça as diluições apropriadas no amortecedor de Elisa. (ex: HRP é 2000X).

c) Deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

5) CARCAÇA

a) Carcaça de Disolve na água.

b) Placa da lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% tween 20 (uso TBS em vez de PBS para o AP).

c) Adicione ul 100 da carcaça a cada poço.

d) Preste atenção ao desenvolvimento da cor. Isto podia fazer exame de alguns segundos a 20 minutos.

e) Se necessitado, pare a reação adicionando ul 50 do NaOH de 4M.

f) Leia o absorption no leitor de Elisa no wavelength correto (para o sistema 416 nm de HRP, para AP - 405 nm).

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03-20-2008 05:43 AM
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