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Anticorpos Polyclonal

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Protocolos Polyclonal do anticorpo:

Anticorpo Polyclonal

Os anticorpos Polyclonal são anticorpos derivados de muitas B-pilhas ou linhas da B-pilha, similares à mistura dos anticorpos encontrados em soros de sangue.

Os anticorpos Polyclonal são conseqüentemente uma mistura de muitas especificidades diferentes do anticorpo.

As preparações Polyclonal do anticorpo compradas são misturas dos anticorpos de muitas especificidades diferentes ao mesmo antígeno.

A imunização de um coelho, do rato, da cabra, da galinha, ou do outro animal produz anticorpos polyclonal. Os soros animais podem ser usados diretamente, porém é melhor purify anticorpos polyclonal para o uso do laboratório.

Preparação Polyclonal do anticorpo

Baseado no protocolo pelo Dr. David Bowtell

Imunização dos ratos:

As injeções para imunizar ratos para a geração de anticorpos polyclonal devem ser feitas em intervalos pelo menos de duas semanas separadas.

Os seguintes 2 adjutores foram bem sucedidos:

Adjutor de Freund e adjutor de MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Pesquisa, Inc.). O MPL é menos perigoso do que o primeiro adjutor.

Para a primeira injeção da imunização: injete 15 - 50 ug se antígeno no adjutor do ul 200, injetado subcutaneously.
A segunda injeção deve ocorrer 2 semanas mais tarde; Você deve então impulsionar com 15 - 50 ug do antígeno no adjutor. (Se o tempo permite, impulsione outra vez um mês mais tarde).
Sete a 10 dias sangra mais tarde o soro do rato e do teste usando o ensaio que será usado para a seleção. Se o titre não é altamente bastante, impulso outra vez duas semanas após o impulso precedente.

PARTE SUPERIOR

Preparação do soro:

Após a coleta, o sangue deve ser permitido coagular por 60 Min. em 37°C ou em O.N em 4°C.
Separe o coágulo dos lados do tubo (soada) que usa uma pipeta do pasteur. Coloc o coágulo em 4°C O.N.
Gire em 10000 x g por 10 Min. em 4°C para separar o soro.
O soro pode ser armazenado em -20°C após ter adicionado o glicerol a 50%.

Se os anticorpos monoclonais estão desejados, uma vez que você manda um “bom” método de seleção polyclonal e de confiança prosiguer à etapa seguinte.

PARTE SUPERIOR

Coelhos:

Os coelhos são imunizados essencialmente como descritos acima. Injeções:

Primeiramente na injeção 100-200ug/1ml completa de Freund, dois locais (sobre cada ombro).
Em segundo 1 mês mais tarde em Freund INCOMPLETO como acima.
Sangramento 2 semanas mais tarde. Impulso 2 semanas mais tarde outra vez (ciclo de 2 + 2 semanas).

PARTE SUPERIOR

PRODUÇÃO DE ANTICORPOS POLYCLONAL NOS COELHOS (BRANCO DE NEUSEELAND)

Baseado no protocolo por Dr.Walter Steffen.

Os coelhos devem ser 3-4 quilogramas no peso e nos aproximadamente 3 meses velho. Sobre um terço do coelho tenha anticorpos e o immunoactivity endógenos da anti-queratina para vários componentes celulares. Isto emfatiza a importância de tomar o soro pre-imune de todo o coelho dado.

Amortecedores e soluções:

Solução saturada do sulfato do amónio, o EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
50 milímetros de acetato de amónio, pH 8.0
álcool etílico de 70%
Adjutor de Freund (completo & incompleto)
Salino protegido fosfato (PBS) (veja abaixo)
Vaseline
Xylene

PARTE SUPERIOR

Traga o coelho de sua gaiola e coloc o firmemente em uma caixa de restrição que sae da orelha acessível. Mantenha a calma do coelho relativamente. Os volumes de sangue até 50 ml podem facilmente ser coletados da artéria principal que funciona abaixo do centro da superfície dorsal da orelha.
Raspe a orelha esquerda em torno da veia esquerda com uma lâmina de lâmina fresca.
Limpe a orelha com álcool etílico ou isopropanol de 70%.
Limpe a orelha com o xylene em torno do laço da artéria-veia para dilatar-se.
Prenda a ponta da orelha (firme) e do tubo da coleção em uma mão e com a inserção da carta branca uma agulha 19G hypodermic na artéria dilatada. O sangue deve começar a fluir imediatamente no tubo da coleção. Para os melhores resultados use uma parcela de artéria intermediária ao longo da orelha.
Colete até 50 ml de sangue. Aplique a pressão apenas anterior ao ponto de entrada da agulha para parar de sangrar.
Aplique o Vaseline à orelha para soothe a irritação do xylene.
Põr o Vaseline extra sobre o corte.

Obtendo o soro:

PARTE SUPERIOR

Tubo de redemoinho com o sangue coletado para revestir a superfície e para impedir o acessório do coágulo ao tubo.
Incube em 37 Oc para 1 hora.
Centrifugue em 2.500 g (ajuste #7 em uma parte superior de tabela clínica) por 10 Min.
Remova o coágulo e gire o soro em 3.000 g por 10 Min.
O soro deve ser armazenado congelado.

Precipitação do sulfato do amónio de IgG do soro (4 Oc, realizado no quarto frio):

A precipitação do sulfato do amónio é um método fácil para obter uma fração razoavelmente pura de IgG.

PARTE SUPERIOR

Soro de associação de um coelho
Soro do peso

W1 = ___ g

Lave os tubos com PBS mínimo e pese-os outra vez.

W2 = ___ g

Adicione 2/3 de volume de sulfato saturado W2 do amónio, o EDTA de 2 milímetros, pH 8.0

Nota: adicione muito lentamente, gota a gota ao agitar em 4 Oc ou use a bomba peristaltic.

Agite por 15 Min.
Transferência aos tubos de centrifugador de 40 ml; taça da lavagem com 3 porções de PBS: 2 porções do sulfato do amónio e adiciona aos tubos.
Rotação em 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 RPM) por 10 Min.
Rejeite o supernatant.
Resuspend a pelota em PBS [1/2 W1 = 1/2 vol.].
Gire em 12.000 g para o minuto 10, rejeite a pelota.
Colete o supernatant na taça, paredes da lavagem com PBS.

Determine W3 = ___

Adicione 2/3 de vol. Sulfato saturado W3 do amónio, ao agitar. Continue o stirring por 15 Min.
Transfira a suspensão aos tubos de centrifugador de 40 ml, tubo da lavagem com solução do sulfato de PBS/ammonium.
Gire em 12.000 g por 10 Min.
Rejeite o supernatant.
Resuspend pelotas em 1/4 de W1 PBS.
Dialize de encontro a PBS, 3 vezes 6 horas cada.
Põr o soro em um tubo graduado, saco da diálise da enxaguadura bem com PBS.
Traga até 1/2 W1 = 1/2 Vol. em PBS.
Determine a concentração e a parte alíquota da proteína para o armazenamento. Meça a absorção em 280 nanômetro. A absorção de 1 mg/ml solução de IgG é aproximadamente 1.5.

Imunização:

PARTE SUPERIOR

Dissolva o antígeno de ~400-600 g (~200-300 g por a injeção) em 2.2 ml 50 milímetros de acetato de amónio, amortecedor apropriado do pH 8.0 ou outro. A concentração depende da antigenitura da proteína a ser injetada.
A quantidade de antígeno necessário para imunizar um animal depende dela antigenitura e o método da imunização. Se as proteínas com baixa antigenitura são usadas, será útil desnaturar a proteína com uma baixa concentração de SDS (até 0.2%). Somente o antígeno altamente purified deve ser usado para a produção de anticorpos polyclonal. Um método fácil para obter um antígeno puro é por SDS-PAGE. As proteínas podem ser transferidas a uma folha da nitrocelulose, ser manchadas com Ponceau S, ser cortada com uma lâmina de lâmina, e ser usada como o antígeno (procure protocolos padrão em SDS-PAGE).
Elabore o adjutor completo de 1.1.ml Freund com uma agulha 20G hypodermic, a seguir elabore 1.1 ml da solução do antígeno. Congele 1.1 ml permanecendo para o impulso.
Mantendo o atuador immobile, remova a agulha e anexe um stopcock estéril de 3 maneiras.
Misture o antígeno com o adjutor anexando uma segunda seringa de vidro ao stopcock e injetando para a frente e para trás. (Cuidado: algumas seringas plásticas puderam reagir com o de óleo mineral.)
Uma emulsão completa será dada forma após o minuto aproximadamente 20-30; indicado por um aumento um pouco repentino na viscosidade da solução.

Após o minuto aproximadamente 20 de mistura da espera antes da injeção a controlar que a mistura está completa (se incompleto, o óleo separará).
Raspe para trás do coelho das omoplatas à pelve.
Limpe para trás com o álcool etílico ou o isopropanol de 70%
Injete sob a pele em aproximadamente 10-20 lados ao longo da espinha entre a omoplata e a pelve usando uma agulha 21G hypodermic. (Nota: Primeira injeção uma semana após o último sangramento do preimmune).
Espere um mês e impulsione-o com uma mistura do antígeno e do adjutor incompleto. Evite cicatrizes da injeção precedente.
Sangre após uma semana para verific para ver se há a imune-resposta. O impulso deve ser repetido, se a resposta imune era demasiado fraca; entretanto, um coelho diferente deve ser escolhido, se o coelho não reagiu de todo. /LI >

Referências: Garvey, J.S., Cremer, nordeste, & Sussdorf, AO. (1977) Em: Métodos na imunologia. Pub. O Benjamin/Cummings Publishing Companhia. Massa das leituras. pp 545

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Seleção do anticorpo Polyclonal usando o ensaio de ELISA

Protocolo de ELISA para a tela do anticorpo:

Materiais para ELISA:

Placas do ° - 96 poço Dynatech Immulon, tipo - 2. (Fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% Tween 20 ou TBS + 0.1% Tween 20.

° que obstrui a solução = 2% BSA (tipo V) em PBS. (Adicione 0.02% azoturetos para um armazenamento mais longo.)

Amortecedor de Elisa do ° = 2% BSA + 0.1% Tween 20 em PBS (azotureto opcional).

Anticorpo do ° = peroxidase lig enzima 1 do Horseradish

Carcaça do ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001) 1

Amortecedor do ° HRP: pH 4.2 do citrato do Na de 100mM (ácido cítrico do magnésio 490 + citrato do Na do magnésio 720

dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2).

Água oxigenada 30% do ° (1000X)

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Protocolo de ELISA para o anticorpo Polyclonal

1) ADSORBTION DO ANTÍGENO

a) AG diluído a 10 ug/ml em PBS.

b) Adicione ul 100 da solução do AG a cada um bem.

c) Deixe O.N coberto com o envoltório de saran, em 4°C.

2) OBSTRUÇÃO

a) O AG unbound lavagem invertendo as placas e passando rapidamente os poços seca.

b) Enxaguadura adicionando PBS a cada um poço e invertendo o outra vez (o uso esguincha o frasco).

c) Repita a enxaguadura duas vezes.

d) Adicione ul 100 de obstruir a solução ao cada bem, deixe 1 hora no Temp do quarto ou O.N em 4°C.

3) ANTICORPO PRELIMINAR

a) Adicione o anticorpo a ser testado:

O Sup das pilhas = ul 25, mistura bem pipeting acima e para baixo (10 vezes).

soro, ascites = 1:100 e um serie de 1/5 das diluições. Faça diluições em obstruir a solução.

b) Deixe 1 hora no temp do quarto ou O.N em 4°C.

4) ANTICORPO SECUNDÁRIO

a) Anticorpo unbound lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% Tween 20.

b) Adicione ul 100 do anticorpo lig enzima a todos os poços. Faça as diluições apropriadas no amortecedor de Elisa. (ex: HRP é 2000X).

c) Deixe 1 hora no temp do quarto ou O.N em 4°C.

5) CARCAÇA

a) Carcaça de Disolve na água.

b) Placa da lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% Tween 20 (uso TBS em vez de PBS para o AP).

c) Adicione ul 100 da carcaça a cada poço.

d) Preste atenção ao desenvolvimento da cor. Isto podia tomar de alguns segundos a 20 Min.

e) Se necessário, pare a reação adicionando ul 50 do NaOH de 4M.

f) Leia a absorção no leitor de Elisa no comprimento de onda correto (para o sistema 416 nanômetro de HRP, para AP - 405 nanômetro).

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