Patrocine/Anuncie & Ligue-nos & Contate-nos & Sobre nós & Ajude-nos

Biologia Molecular Blog

Bornes Recentes Do Forum

 

Antibodies De Polyclonal

Toda sobre antibodies do polyclonal.

Recursos Externos Relacionados Do Antibody De Polyclonal - Protocolos:

• Borrão Ocidental
• Immunoblot
• Immunoprecipitation (IP)
• Criação dos antibodies usando peptides

Também estação do antibody da visita para mais em antibodies de Polyclonal. É um local novo que aliste fornecedores do antibody, aprende sobre antibodies, e protocolos.

Protocolos do antibody de Polyclonal:

• Ratos Immunizing
• Preparação do serum do sangue
• Immunization Do Coelho
• Procedimento do sangramento do coelho
• Obtendo o serum
• Precipitação do sulfate do ammonium de IgG do serum
• Immunization
• Protocolo de ELISA para a seleção do antibody de Polyclonal

Antibody De Polyclonal

 

Os antibodies de Polyclonal são antibodies derivados de muitas B-pilhas ou linhas da B-pilha, similares à mistura dos antibodies encontrados em sera de sangue.

Os antibodies de Polyclonal são conseqüentemente uma mistura de muitos specificities diferentes do antibody.

As preparações do antibody de Polyclonal compradas são misturas dos antibodies de muitos specificities diferentes ao mesmo antígeno.

O immunization de um coelho, do rato, da cabra, da galinha, ou do outro animal produz antibodies do polyclonal. Os sera animais podem ser usados diretamente, porém é melhor purify antibodies do polyclonal para o uso do laboratório.

Preparação Do Antibody De Polyclonal

Baseado no protocolo pelo Dr. David Bowtell

Immunization dos ratos:

As injeções para immunize ratos para a geração de antibodies do polyclonal devem ser feitas em intervalos ao menos de duas semanas separadas.

Os seguintes 2 adjutores foram bem sucedidos:

• Adjutor de Freund e adjutor de MPL+TDM (RIBI ImmunoChem Pesquisa, Inc.). O MPL é mais menos perigoso do que o primeiro adjutor.

1. Para a primeira injeção do immunization: injete 15 - 50 ug se antígeno no adjutor do ul 200, injetado subcutaneously.
2. A segunda injeção deve ocorrer 2 semanas mais tarde; Você deve então impulsionar com 15 - 50 ug do antígeno no adjutor. (se o tempo permitir, impulsione outra vez um mês mais tarde).
3. Sete a 10 dias sangra mais tarde o serum do rato e do teste usando o assay que será usado para a seleção. Se o titre não for altamente bastante, impulso outra vez duas semanas após o impulso precedente.

ALTO

Preparação Do Serum:

1. Após a coleta, o sangue deve ser permitido clot por 60 minutos. em 37°C ou em O.N em 4°C.
2. Separe o clot dos lados do tubo (soar) que usa uma pipeta do pasteur. Coloque o clot em 4°C O.N.
3. Gire em 10000 x g por 10 min. em 4°C para separar o serum.
4. O serum pode ser armazenado em -20°C após ter adicionado o glycerol a 50%.

Se monoclonal os antibodies estão desejados, uma vez que você manda um polyclonal "bom" e um método de seleção de confiança proseguir à etapa seguinte.

ALTO

Coelhos:

Os coelhos immunized essencialmente como descritos acima. Injeções:

1. Primeiramente na injeção 100-200ug/1ml completa de Freund, dois locais (sobre cada ombro).
2. Em segundo 1 mês mais tarde em Freund INCOMPLETO como acima.
3. Sangramento 2 semanas mais tarde. Impulso 2 semanas mais tarde outra vez (ciclo de 2 + 2 semanas).

ALTO

 

PRODUÇÃO DE ANTIBODIES DE POLYCLONAL NOS COELHOS (BRANCO DE NEUSEELAND)

Baseado no protocolo por Dr.Walter Steffen.

Os coelhos devem ser 3-4 quilogramas no peso e nos aproximadamente 3 meses velho. Sobre um third do coelho tenha antibodies e o immunoactivity endogenous do anti-anti-keratin para vário outros componentes celulares. Isto emfatiza a importância de fazer exame do serum pre-imune de todo o coelho dado.

Amortecedores e soluções:

• Solução saturated do sulfate do ammonium, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
• 50 milímetros de acetato do ammonium, pH 8.0
• ethanol de 70%
• Adjutor de Freund (completo & incompleto)
• Saline protegido phosphate (PBS) (veja abaixo)
• Vaseline
• Xylene

ALTO

• Traga o coelho de sua gaiola e coloque-o firmemente em uma caixa contendo que sae da orelha acessível. Mantenha a calma do coelho relativamente. Os volumes do sangue até 50 ml podem fàcilmente ser coletados do artery principal que funciona abaixo o centro da superfície dorsal da orelha.
• Raspe a orelha esquerda em torno da veia esquerda com uma lâmina de razor fresca.
• Limpe a orelha com ethanol ou isopropanol de 70%.
• Limpe a orelha com o xylene em torno do laço da artery-veia para dilate.
• Prenda a ponta da orelha (firmemente) e do tubo da coleção em uma mão e com a inserção livre da mão uma agulha 19G hypodermic no artery dilated. O sangue deve começar a fluir imediatamente no tubo da coleção. Para os mais melhores resultados use uma parcela do artery intermediária ao longo da orelha.
• Colete até 50 ml de sangue. Aplique a pressão apenas anterior ao ponto da entrada da agulha ao sangramento do batente.
• Aplique o vaseline à orelha para soothe a irritação do xylene.
• Ponha o vaseline extra sobre o corte.

Obtendo O Serum:

ALTO

• Tubo de redemoinho com o sangue coletado para revestir a superfície e para impedir o acessório do clot ao tubo.
• Incubate no oC 37 para 1 hora.
• Centrifuge em 2.500 g (que ajusta #7 em um alto de tabela clínico) por 10 minutos.
• Remova o clot e gire o serum em 3.000 g por 10 minutos.
• O serum deve ser armazenado congelado.

Precipitação do sulfate do ammonium de IgG do serum (oC 4, realizado no quarto frio):

A precipitação do sulfate do ammonium é um método fácil para obter uma fração razoavelmente pura de IgG.

ALTO

• Serum do pool de um coelho
• Serum do peso
W1 = _____ g
• Tubos da lavagem com minuto. PBS e pesam outra vez.
W2 = _____ g
• Adicione 2/3 de volume do sulfate saturated W2 do ammonium, EDTA de 2 milímetros, pH 8.0
Nota: adicione muito lentamente, dropwise ao agitar no oC 4 ou use a bomba peristaltic.
• Agite por 15 minutos.
• Transferência aos tubos de centrifugador de 40 ml; taça da lavagem com 3 porções de PBS: 2 porções do sulfate do ammonium e adiciona aos tubos.
• Rotação em 12.000 g (Beckman JA-20: 10.000 RPM) por 10 minutos.
• Rejeite o supernatant.
• Resuspend a pelota em PBS [ 1/2 W1 = 1/2 vol. ].
• Gire em 12.000 g por 10 minutos, rejeite a pelota.
• Colete o supernatant na taça, paredes da lavagem com PBS.
Determine W3 = _____
• Adicione 2/3 de vol. Sulfate saturated W3 do ammonium, ao agitar. Continue agitando por 15 minutos.
• Transfira a suspensão aos tubos de centrifugador de 40 ml, tubo da lavagem com solução do sulfate de PBS/ammonium.
• Gire em 12.000 g por 10 minutos.
• Rejeite o supernatant.
• Resuspend pelotas em 1/4 de W1 PBS.
• Dialize de encontro a PBS, 3-times 6 horas cada.
• Ponha o serum em um tubo graduado, saco do dialysis da enxaguadura bem com PBS.
• Traga até 1/2 W1 = 1/2 vol. em PBS.
• Determine a concentração e o aliquot da proteína para o armazenamento. Meça o absorption em 280 nm. O absorption de 1 solução de mg/ml IgG é aproximadamente 1.5.

Immunization:

ALTO

• Dissolva o antígeno de ~400-600 g (~200-300 g por a injeção) em 2.2 ml 50 milímetros de acetato do ammonium, amortecedor apropriado do pH 8.0 ou outro. A concentração depende do antigenicity da proteína a ser injetada.
• A quantidade de antígeno necessitada immunize um animal depende dela antigenicity e o método do immunization. Se as proteínas com antigenicity baixo forem usadas, será útil desnaturar a proteína com uma concentração baixa de SDS (até 0.2%). Somente o antígeno altamente purified deve ser usado para a produção de antibodies do polyclonal. Um método fácil para obter um antígeno puro é por SDS-PAGE. As proteínas podem ser transferidas a uma folha de nitrocellulose, ser manchadas com Ponceau S, ser cortada com uma lâmina de razor, e ser usada como o antígeno (procure protocolos padrão em SDS-PAGE).
• Desenhe acima do adjutor completo de 1.1.ml Freund com uma agulha 20G hypodermic, desenhe então acima de 1.1 ml da solução do antígeno. Congele 1.1 ml restantes para o impulso.
• Mantendo o atuador immobile, remova a agulha e una um stopcock 3-way sterile.
• Misture o antígeno com o adjutor unindo um segundo syringe de vidro ao stopcock e injetando para a frente e para trás. (cuidado: alguns syringes plásticos puderam reagir com o óleo mineral.)
• Um emulsion completo será dado forma após aproximadamente 20-30 minutos; indicado por um aumento rather repentino na viscosidade da solução.

Cuidado: seja certo que a montagem é segura!
• Após a espera misturando aproximadamente 20 minutos antes da injeção ao controle que a mistura está completa (se incompleto, o óleo separará).
• Raspe para trás do coelho das lâminas do ombro ao pelvis.
• Limpe para trás com o ethanol ou o isopropanol de 70%
• Injete sob a pele em aproximadamente 10-20 lados ao longo do spine entre a lâmina do ombro e o pelvis usando uma agulha 21G hypodermic. (nota: Primeira injeção uma semana após o último sangramento do preimmune).
• Espere um mês e impulsione-o com uma mistura do antígeno e do adjutor incompleto. Evite cicatrizes da injeção precedente.
• Sangre após uma semana para verificar para ver se há a imune-resposta. O impulso deve ser repetido, se a resposta imune for demasiado fraca; entretanto, um coelho diferente deve ser escolhido, se o coelho não reagir no todo /LI >

Referências: Garvey, J.S., Cremer, Nordeste, & Sussdorf, AO (1977) Em: Métodos no immunology. Publicação. O Benjamin/Cummings Publishing Companhia. Massa Das Leituras. pp 545

ALTO

Seleção do antibody de Polyclonal usando o assay de ELISA

Protocolo de ELISA para a tela do antibody:

Materiais para ELISA:

placas do ° - 96 poço Dynatech Immulon, tipo 2. (fisher 17-0221-199).

° PBS, TBS

° PBS + 0.1% tween 20 ou TBS + 0.1% tween 20.

° que obstrui a solução = 2% BSA (tipo V) em PBS. (adicione 0.02% azide para um armazenamento mais longo.)

amortecedor de Elisa do ° = 2% BSA + 0.1% tween 20 em PBS (azide opcional).

antibody do ° = peroxidase ligados enzyme 1 do horseradish

carcaça do ° = ABTS - 100X (de Zymed 00-2001)1

amortecedor do ° HRP: ácido citric do magnésio do pH 4.2(490 do citrato do Na de 100mM + citrato do Na do magnésio 720

dihydrate + 50 ml H2O, pH 4.2).

peroxide de hidrogênio 30% do ° (1000X)

ALTO

Protocolo de ELISA para o antibody de Polyclonal

1) ADSORBTION DO ANTÍGENO

a) AG diluído a 10 ug/ml em PBS.

b) Adicione ul 100 da solução do AG a cada um bem.

c) Deixe O.N coberto com o envoltório de saran, em 4°C.

2) OBSTRUÇÃO

a) O AG unbound da lavagem invertendo as placas e flicking os poços seca.

b) Enxaguadura adicionando PBS a cada um poço e invertendo o outra vez (o uso esguincha o frasco).

c) Repita a enxaguadura duas vezes.

d) Adicione ul 100 de obstruir a solução ao cada bem, deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

3) ANTIBODY PRELIMINAR

a) Adicione o antibody a ser testado:

Sup das pilhas = ul 25, mistura bem pipeting acima e para baixo (10 vezes).

serum, ascites = 1:100 e um serie de 1/5 das diluições. Faça diluições em obstruir a solução.

b) Deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

4) ANTIBODY SECUNDÁRIO

a) Antibody unbound da lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% tween 20.

b) Adicione ul 100 do antibody ligado enzyme a todos os poços. Faça as diluições apropriadas no amortecedor de Elisa. (ex: HRP é 2000X).

c) Deixe 1 hora na temperatura de quarto ou no O.N em 4°C.

5) CARCAÇA

a) Carcaça de Disolve na água.

b) Placa da lavagem 4 vezes com PBS + 0.1% tween 20 (uso TBS em vez de PBS para o AP).

c) Adicione ul 100 da carcaça a cada poço.

d) Preste atenção ao desenvolvimento da cor. Isto podia fazer exame de alguns segundos a 20 minutos.

e) Se necessitado, pare a reação adicionando ul 50 do NaOH de 4M.

f) Leia o absorption no leitor de Elisa no wavelength correto (para o sistema 416 nm de HRP, para AP - 405 nm).

ALTO

Outros Web site Do Antibody

Veja que estação do antibody é um local novo que cubra antibodies, fornecedores do antibody, e a outra informação antibody-relacionada.

Encontre outros antibody e tópicos monoclonal relacionados do antibody aqui: