Electroforese do gel do Agarose

Este local da electroforese do gel do Agarose é seu portal para todas as coisas relativas à técnica da electroforese do gel do agarose e a sua análise. Nós fornecemo-lo toda a informação de fundo, protocolos, etapas da análise, visualização e informação de pesquisa de defeitos para geles running do agarose para que o ADN, o RNA ou a proteína assente bem no perito final na electroforese do gel do agarose!

Índice da electroforese do gel do Agarose

Que é electroforese do gel do Agarose?

A electroforese do gel do Agarose é um método usado na bioquímica e na biologia molecular para separar o ADN, ou as moléculas do RNA por proteínas do tamanho entretanto podem igualmente ser separadas em geles do agarose. A separação das moléculas é conseguida movendo negativamente - moléculas carregadas do ácido nucleico através de uma matriz do agarose em um campo elétrico (veja a electroforese). Umas moléculas mais curtas movem-se mais rapidamente e migram-se mais do que mais por muito tempo.

electroforese do gel do agarose

Aplicações da electroforese do gel do Agarose

A electroforese do gel do Agarose é usada principalmente na análise ou na separação de moléculas do ADN e do RNA (embora as proteínas podem igualmente ser separadas em geles do agarose), porém a separação igualmente permite a purificação de tamanhos específicos de DNAs após a digestão da enzima da limitação. Isto é usado geralmente em clonar para obter os plasmídeo do corte, em que a electroforese do gel do agarose separa vetores do corte dos uncut.

Assim os geles do agarose reservam:

A separação de enzima da limitação digeriu o ADN que inclui o ADN genomic, antes de transferência do sul do borrão. É igualmente usada frequentemente para separar o RNA antes de transferência do norte.
Análise de produtos do PCR após a reacção em cadeia do polymerase avaliar para a amplificação do ADN do alvo.
Permite a avaliação do tamanho de moléculas do ADN usando um marcador ou uma escada do ADN que contenha fragmentos do ADN de vários tamanhos conhecidos.
Permite a avaliação áspera da quantidade e da qualidade do ADN.
A quantidade é avaliada usando a escada do ADN do lambda que contem quantidades específicas de ADN em faixas diferentes.
A qualidade do ADN é avaliada observando a ausência de lista ou de fragmentos (ou de contaminar faixas do ADN).
Outras técnicas confiam na electroforese do gel do agarose para a separação do ADN que inclui o fingerprinting de ADN.

As vantagens e as desvantagens do Agarose coagulam a electroforese

As vantagens são que o gel está derramado facilmente, não desnaturam as amostras. As amostras podem igualmente ser recuperadas.

As desvantagens são que os geles podem derreter durante a electroforese, o amortecedor podem tornar-se esgotadas, e os formulários diferentes do material genético podem funcionar em formulários impredizíveis.

Migração em geles do Agarose

A maioria de factor importante está a um comprimento da molécula do ADN, moléculas menores viaja mais distante. Mas a conformação da molécula do ADN é igualmente um fator. Para evitar moléculas lineares deste problema são separados geralmente, geralmente fragmentos do ADN de um sumário da limitação, produtos lineares do PCR do ADN, ou RNAs.

Aumentar a concentração do agarose de um gel reduz a velocidade da migração e permite a separação de moléculas menores do ADN. Mais elevada a tensão, mais rapidamente o ADN migra. Mas a tensão é limitada pelo fato de que aquece e faz com finalmente que o gel derreta. As altas tensões igualmente diminuem a definição (acima de aproximadamente 5 a 8 V/cm). [citação necessário]

As conformações de um plasmídeo do ADN que não seja cortado com uma enzima da limitação mover-se-ão com as velocidades diferentes (as mais lentas a o mais rapidamente): entalhado ou abra o plasmídeo circular, tornado linear, ou supercoiled.

Limites de resolução de geles do Agarose

Os geles do Agarose podem ser usados para a separação de fragmentos do ADN que variam de 50 pares baixos a diversos megabases (milhões das bases) pela electroforese. Mais geralmente entretanto, a electroforese do gel do agarose é usada para separar aproximadamente o ADN do PCR e do clonagem na escala de 100bp a 15kb. Os tempos de execução são aproximadamente 30 minutos - 1 hora de comprimento.

DNAs ou RNAs pequeno (menor do que 100bp) são separados melhor por geles de polyacrylamide, porém 2-3% geles do agarose podem ser adequados separar mesmo os fragmentos 50bp dos ácidos nucleicos muito maiores.

Recentemente entretanto, mostrou-se que até uma diferença baixa do tamanho dos pares poderia ser resolved em um gel do agarose de 3% com extremamente - o baixo media da condutibilidade tal como 1 milímetro de borato do lítio (JÚNIOR de Brody, Calhoun ES, Gallmeier E, Creavalle SE do TD, Kern (2004). Electroforese high-resolution Ultra-fast do agarose do ADN e do RNA usando baixos-molarity media condutores. Biotechniques. 37:598 - 602.).

Tabela da porcentagem do gel do Agarose e da escala eficiente da separação:

porcentagem do gel do agarose

Como você pode ver que os baixos geles do agarose da porcentagem são os melhores para a separação de grandes moléculas do ADN, visto que elevado os geles da porcentagem são os melhores para DNAs menor.

Purificação do ADN com extração do gel do Agarose

Como mencionado antes, a electroforese do gel do agarose permite a separação e assim a purificação do ADN para o clonagem. Entretanto, isto exige geralmente agarose do derretimento da pureza elevada o baixo se o ADN deve ser extraída do gel.

Amortecedores da electroforese do gel do Agarose

Dependendo do tamanho do ADN electrophoresed e a aplicação, amortecedores diferentes pode ser usada para a electroforese do agarose. O amortecedor de TAE (ou o EDTA do acetato de Tris) são o amortecedor usado o mais comum da electroforese do gel do agarose. TAE tem a mais baixa capacidade de protecção dos amortecedores, porém TAE oferece a melhor definição para o ADN maior. Entretanto, TAE exige uma tensão mais baixa e mais tempo.

Entretanto o amortecedor de TBE (Tris/Borate/EDTA) é usado frequentemente para os fragmentos menores do ADN (IE menos do que 500bp).

O borato de sódio ou o amortecedor do SB são um amortecedor novo, porém é ineficaz para o kb de 5 maior de resolução dos fragmentos. Entretanto o SB tem vantagens em sua baixa condutibilidade, permitindo umas mais altas tensões (até 35 V/cm). Isto podia reservar uma estadia de análise mais curta para a electroforese rotineira.

Artigos da electroforese do gel do Agarose

Electroforese do gel do Agarose do RNA

Electroforese do RNA

Visualização do RNA

Electroforese do gel do ADN

Brometo de Ethidium

Amortecedor de TBE

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Extração do gel

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Purificação da extração do gel do Agarose do ADN

Borrão do norte

Borrão do sul

Isolação do RNA

Protocolos da electroforese do gel do Agarose

Protocolos da preparação do gel do Agarose

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