Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

RNA Protocols RNA Protokoły

RNA Encyclopedia RNA Encyklopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatyka

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Aktualności

RNA Isolation Izolacja RNA

RNA Extraction Background Information Ekstrakcja RNA Informacje

Obtaining high quality, intact RNA is the first and often the most critical step in performing many fundamental molecular biology experiments, including Northern analysis, nuclease protection assays, RT-PCR, RNA mapping, in vitro translation and cDNA library construction. Uzyskanie wysokiej jakości, nienaruszonym RNA jest pierwsze i często najważniejsze krok w realizacji wielu podstawowych eksperymentów biologii molekularnej, w tym analiza Północnej, nukleazy ochrony analiz, RT-PCR, RNA map, in vitro, tłumaczenia i budowy biblioteki cDNA. To be successful, however, the RNA isolation procedure should include some important steps both before and after the actual RNA purification. Aby odnieść sukces, jednak do izolacji RNA procedury powinny zawierać pewne istotne kroki, zarówno przed jak i po rzeczywistej oczyszczania RNA.

Basic RNA Isolation Methods Podstawowe metod izolacji RNA

Depending on the RNA to be extracted, there are properties of RNA that allow it to be isolated away from other cellular materials such as proteins, DNA and even lipids. W zależności od RNA, które mają być wyodrębnione, nie są właściwości RNA, które pozwalają mu zostać odizolowane od innych materiałów komórkowych, takich jak białka, tłuszczu, a nawet DNA.

Messenger RNA or mRNA contains a stretch adenosine residues in the form of a poly(A) tail. Messenger RNA lub mRNA zawiera wycinki adenozyny pozostałości w postaci poli (A) ogon. This has been exploited to allow mRNA to be bound to poly(T) affinity columns or beads. Propozycja ta została wykorzystana do umożliwienia mRNA być związana z poli (T) kolumny powinowactwa lub kulek.

Tips for RNA Extraction and Isolation Porady dotyczące wyodrębniania i RNA Isolation

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Jeśli mają obecnie preferowaną metodą izolowania RNA, nadal z niego korzystać.

If you haven't isolated RNA from your system before and your organism is not on the following list, we can help you identify established protocols that have been used for isolating RNA for Northern blotting or RT-PCR from your system. Jeśli nie masz jeszcze RNA wyizolowane z systemu, zanim Twój organizm i nie znajduje się na poniższej liście, możemy pomóc w identyfikacji ustanowionych protokołów, które zostały użyte do izolowania RNA Północnej blotting lub RT-PCR z systemu. These types of protocols will also yield "microarray-grade" RNA. Te typy protokołów będzie również plon "microarray klasy" RNA.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Zawsze uruchomić żelu agarozowym swojego RNA do oceny jakości.

NOTE: If you use a non column based purification reagent such as TRIzol we recommend you precipitate your RNA a second time from ethanol or you pass it through an Rneasy column or similar device. UWAGA: Jeśli używana jest kolumna nie opiera się oczyszczanie odczynników, takich jak TRIzol polecamy swoje RNA osad po raz drugi z etanolu lub przekazać je za pośrednictwem Rneasy kolumnie lub podobne urządzenie. This insures removal of all organic contaminants (See spectra below). To gwarantuje usunięcie wszystkich zanieczyszczeń organicznych (patrz poniżej widm).

RNase Inhibitors Used in RNA Extraction and Isolation RNase inhibitory używane w RNA Extraction i izolacji

Checking RNA Isolation Quality and Quantity Izolacja RNA Sprawdzanie jakości i ilości

Efficient nuclear/cytoplasmic fractionation can be quickly assessed by denaturing agarose gel analysis (see Figure 1). Skuteczna jądrowej / cytoplasmic frakcjonowanie może być szybko ocenione przez denaturacji żelu agarozowym analizy (patrz rys. 1). Bands correspond-ing to precursor rRNA should be equivalent in the total and nuclear RNA fraction. Zespoły odpowiadają-ing do prekursorów rRNA powinny być równoważne w ogólnej i ułamek jądrowych RNA. The 18S and 28S rRNA bands will be less intense in the nuclear RNA fraction than in either total RNA or cytoplasmic fraction RNA. W 18S i 28S rRNA zespoły będą mniej intensywne w jądrowych RNA niż w ułamek całkowitej albo RNA lub ułamek cytoplasmic RNA. In some cell lines, for example 293 and COS-7 cells, this difference will be dramatic, but in other cells lines such as HeLa cells, the rRNA bands are only slightly less intense in nuclear RNA than in total or cytoplasmic fraction RNA." W niektórych linii komórkowych, na przykład 293 i COS-7 komórek, różnica ta zostanie dramatyczne, ale w innych komórkach hela linie takie jak komórki, rRNA zespołów są tylko nieznacznie mniej intensywne niż w jądrowych RNA w całości lub w części cytoplasmic RNA ".

RNA Purity RNA czystości

A260 readings and 260/280 ratios are not enough to ensure high purity RNA. A260 odczyty i 260/280 wskaźników nie są wystarczające do zapewnienia wysokiej czystości RNA. You must take a full UV spectrum. Użytkownik musi mieć pełne spektrum UV. Below are 3 example spectra which all have good 260/280 ratios, but have very different purities. Poniżej przedstawiono przykład 3 widm, które mają dobry stosunek 260/280, ale mają bardzo różne purities. You can also use the 260/230 ratio to help determine the amount of organic contamination in your RNA. Można również użyć 260/230 uważać, aby określić kwotę organiczne zanieczyszczenia w Twoim RNA. It is a much more variable number than the 260/280 ratio, but generally, ratios above 1 indicate good purity. Jest to znacznie więcej niż zmienna numer 260/280 stosunek, ale ogólnie rzecz biorąc, wskaźniki powyżej 1 wskazują dobrej czystości.

Quantifying RNA Extraction and Isolation Liczenie i izolacji RNA Extraction

RNA Isolation from Subcellular Fractions Izolacja RNA z Subcellular Ułamki

Cells were then washed in PBS and successively extracted as described. Komórki zostały następnie myte w PBS, a następnie ekstrahuje się z opisem. First, cells were extracted with the Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Po pierwsze, komórki zostały wyodrębnione z Nonidet P-40 buforze (10 mM Tris-Cl, (pH 7,5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 jednostek / ml Rnasin, 1 mm DTT). The remaining pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) and nucleus) was washed in the same buffer and extracted in buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 mM EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Pozostałe osadu (Retikulum endoplazmatyczne szorstkie (RER) i jądra) myte w tym samym buforze i wyodrębnione w buforze B (10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 10 mM NaCl, 0,5% (v / v) Nonidet P-40 , 40 mM EDTA, 40 jednostek / ml Rnasin, 1 mM DTT). The remaining nuclear pellet was washed in the same buffer and extracted with high salt buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Pozostałe jądrowej osadu było myte w tym samym buforze i wyodrębnione z wysokiej soli buforowych (10 mM Tris-Cl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 sztuk / Rnasin ml, 1 mM DTT). RNA was purified from each fraction by the RNA STAT solution. RNA został oczyszczony z każdej frakcji przez RNA STAT rozwiązanie. Total RNA was isolated using the RNA-STAT60 reagent (Tel-test) according to the instructions provided by the manufacturer. Razem RNA został wyizolowany przy użyciu RNA-STAT60 odczynnika (Tel-test) według instrukcji dostarczonych przez producenta. (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002) (Nr referencyjny: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

RNA Isolation Using CsCl Protocol Izolacja RNA Korzystanie z protokołu CsCl

Chaos Buffer for RNA isolation Chaos Bufor do izolacji RNA

For 100 mls 200 mls Na 100 mls mls 200

4. 5M Guanidinium thiocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls 5M guanidyny 53,2 g rodanku 106,4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mm EDTA 0.5M 10 mls mls 20-25mm Tris HCl, pH 7,5 1M 2,5 mls mls 5

0. 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls 1M b-merkaptoetanolu 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul 2% antifoam (Sigma) 200 ul ul 400

5. 7 M CsCl cushion* Final Volume 100 ml 7 M CsCl poduszka * końcowej objętości 100 ml

5. 7 M "Baked" CsCl 95.8g 7 M "Baked" CsCl 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls 1M EDTA 0.5M 20 mls

RNA Extraction Procedure Using CsCl Ekstrakcja RNA Procedura Korzystanie CsCl

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Używaj DEPC traktowane wody i pieczone szkła. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. To rozwiązanie, absolutnie pozytywny, muszą być wolne Rnase. Rnase is everywhere! Rnase jest wszędzie! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Założyć rękawice, należy użyć tylko pieczone szkła, tworzywa sztucznego lub z pierwszego tłoczenia. DePC treat your water, buffers (except Tris). DePC leczeniu woda, bufory (z wyjątkiem Tris). Be very careful. Trzeba być bardzo ostrożnym.

1. Weigh animal. Zważyć zwierząt. Remove organ (liver), weight One of the superior attributes of cDNA is you reduce the gene complexity by choosing an organ that only expresses a single locus of a multilocus enzyme. Usuń organów (wątroby), waga Jednym z najwyższej atrybuty cDNA jest zmniejszenie złożoności genów poprzez wybór organu, że wyraża tylko jednego miejsca na multilocus enzymu. 2 . 2. Homogenize tissue rapidly in "Chaos" buffer (9mls) 3 . Homogenizować tkanki szybko "Chaos" bufor (9mls) 3. Spin homogenant at 12 KG to remove insoluble material 4 . Spin homogenant na 12 kg do usunięcia nierozpuszczalnego materiału 4. WHILE Homogenant IS SPINNING 4A. Chociaż Homogenant JEST Przędzalnictwa 4A. Weight out 1.8 g of CsCl (0.2g/ml) per sample. Waga, 1,8 g CsCl (0.2g/ml) na próbkę. 4B. In the ultra-centrifuge tube ("quick-seal") add 3.5mls of 5.7M CsCl "cushion" This layer must be Rnase free. W ultra-wirówki ( "quick-plomba") dodać 3.5mls z 5.7M CsCl "poduszka" Ta warstwa musi być wolne Rnase. You will centrifuge your RNA through this layer and any contamination will cause significant losses. Będziesz wirować swoje RNA poprzez tę warstwę i wszelkie zanieczyszczenia spowodują znaczne straty. 5 . 5. Remove supernant, put into fresh tube, add 1.8 g CsCl 6 . Usuń supernant, wprowadzane do świeżej probówki, dodać 1,8 g CsCl 6. Carefully, add homogenant on top of the CsCl cushion. Ostrożnie dodać homogenant na górę CsCl z poduszką. This is most readily accomplished by using a 10cc syringe and long needle. Jest to najbardziej łatwo osiągnąć za pomocą 10cc długie igły i strzykawki. Place needle/syringe into quick-seal tube, and add tissue homogenant to the syringe. Miejsce igły / strzykawki do szybkiego Pieczęć probówki i dodać tkanki homogenant do strzykawki. Homogenant will slowly trickle into QS tube, floating on top of the cushion. Homogenant będzie powoli trickle QS do rurki, unoszące się na górę z poduszką.

7. Carefully, balance matched pairs of centrifuge tube (+/-0.005 g). Ostrożnie, saldo dopasowanie par wirówki (+ / -0,005 g).

8. Seal tubes, place matched tubes opposite of each other and cap with red aluminum tops. Pieczęć rury, dopasowane rurki miejsce naprzeciwko siebie i kapelusz z czerwoną aluminiowe blaty.

9. Centrifuge, 50,000 rpms 5.5 hrs, 20oC Wirówka, 50.000 rpms 5,5 godz, 20oC

After centrifugation: Mark tubes where pellet should be: on the bottom outer side (relative to center of rotor) Po odwirowaniu: Mark rury osadu, gdzie powinien być: na dole strony zewnętrznej (w stosunku do centrum wirnika)

10. Remove tubes, place in convenient rack. Usuń rury, wygodne miejsce w obudowie.

11. Slice off the top of tube.Aspirate off the top 2/3- 3/4 of solution. Kromka wierzchołka tube.Aspirate wierzchołka 2/3- 3 / 4 roztworu. WORK FROM THE TOP DOWN. WORK FROM THE TOP DOWN. IT IS IMPORTANT THAT YOU ASPIRATE OFF THE UPPER MOST SOLUTION FIRST AND REMOVE ALL BUT THE CLEAR CUSHION. Ważne jest, aby nabrać OFF THE MOST górna roztworu pierwszy i usunąć wszystkie, ale jasne CUSHION. DO NOT ASPIRATE THE INVISIBLE PELLET AT THE BOTTOM. NIE nabrać niewidzialna BRYKIETY Z BIOMASY na dole.

12. Cut off the top 2/3 of tube. Odciąć górę 2 / 3 z probówki. Using a "pulled" Pasteur pipet, carefully remove remaining solution. Korzystanie z "wciągnięta" Pasteur pipetą, dokładnie usunąć pozostałe rozwiązania. The pellet will be on the bottom-side of the tube. Osad będzie na dole strony rurkę.

13. Rinse pellet with 70% EtOH, remove (use Pasteur pipets), repeat twice (total 3 washes) Spłukać osadu z 70% EtOH, usunąć (wykorzystanie Pasteur pipets), powtórzyć dwukrotnie (razem 3 prania)

14. Add 200 ul of 0.1x TE (RNase free), using the pipet tip to crush pellet and "titrating" TE attempt to put pellet into solution. Dodać 200 z ul 0.1x TE (RNase free), korzystając z pipetą wskazówka do sympatii osadu i "titrating" TE próba wprowadzenia osadu w roztworze. At least form a heterogeneous solution and put into a fresh microfuge tube. Przynajmniej tworzy różnorodną roztworu i umieścić w świeżej microfuge rurki.

15. Repeat with 200 ul of TE pooling both solutions Powtórz z 200 ul EW łączenie obu rozwiązań

16. Vortex, good RNA does not like to go into solution. Vortex, dobre RNA nie chce iść do rozwiązania. Patience is a virtue. Cierpliwość jest racji.

17. Determine concentration, 10 ul into 490 ul (500 ul final vol) Oznaczyć stężenie, ul 10 do 490 ul (500 końcowy ul tom)

18. Remove 1 to 2 ug of RNA for gel analysis (add RNA loading buffers) Usuń od 1 do 2 ug RNA żel do analizy (dodaj RNA załadunku buforów)

19. Add 1/10 volume Rnase free 3M NaOAC (40 ul), 2.5 volumes of EtOH (1.0ml). Dodaj 1 / 10 objętości Rnase wolne 3M NaOAC (40 ul), 2,5 wielkości EtOH (1.0ml). Mix vigorously. Wymieszać energicznie.

20. You can calculate the concentration of RNA in the EtOH.Thus, there is no need to precipitate all of your RNA at once. Można obliczyć stężenie RNA w EtOH.Thus, nie ma potrzeby, aby osad wszystkie swoje RNA na raz. Just remove about 1.5 to 2 times the amount you need by vortexing EtOH/RNA solution and remove the appropriate volume. Wystarczy usunąć około 1,5 do 2 razy większa od kwoty trzeba by vortexing EtOH / RNA rozwiązanie i usunięcie odpowiedniej wielkości. This EtOH/RNA solution stored at 20oC or lower, is stable for years. Tę EtOH / RNA roztwór przechowywany na poziomie 20 ° lub niższym, jest stabilne od lat.

See: Zobacz:

RNA Protocols RNA Protokoły

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatyka