Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

RNA Protocols RNA Protokoły

RNA Encyclopedia RNA Encyklopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatyka

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA Blog

RNA News RNA Aktualności

Northern Blot Hybrydyzacja northern

Copyright 2007 - Molecular Station Copyright 2007 - Molekularnej Station

AUDIO AUDIO Listen to a detailed Northern Blot Explanation ! Słuchaj szczegółowe Hybrydyzacja northern Wyjaśnienie!

History of Northern Blotting Historia Northern blotting

Northern blotting is an RNA blotting technique which was developed in 1977 by Alwine et al. Northern blotting jest blotting techniki RNA, który powstał w 1977 roku przez Astoria et al. at Stanford University (ref:1). na Uniwersytecie Stanforda (nr ref: 1). It was named after the Southern blot technique which blots for DNA, invented by Edwin M. Southern in 1975. Western blot , a method for blotting for proteins is also a play on the Southern blot naming and was named in 1981 (ref:2). Było po nazwie Southern blot techniki, które blots DNA, wymyśloną przez Edwin M. południowej w 1975 roku. Western blot, metody blotting dla białek jest również grać na Southern blot nazewnictwa i został nazwany w 1981 r. (nr ref: 2) .

Background Information - Northern Blot Technique Informacje - Northern Blot Technika

Northern analysis despite its age in the high tech world of Real Time PCR, nuclease protection assays (RPAs) and microarrays, is still the gold-standard for the detection and quantitation of mRNA levels. Północnej analizy pomimo jego wieku w świat wysokich technologii Real Time PCR, nukleazy ochrony analiz (RPAs) i microarrays, nadal jest złoto-standard dla wykrywania i ilościowego na poziomie mRNA. This is because northern blot analysis allows a direct comparison of the messenger RNA abundance between samples on a single membrane. Dzieje się tak, ponieważ Hybrydyzacja northern analiza pozwala na bezpośrednie porównanie z MRNA obfitości między próbek na jednym z membraną.

In northern blot the main difference between the other blotting techniques is that RNA is the factor being detected. W Hybrydyzacja northern główna różnica między innymi blotting techniki RNA, że jest to czynnik zostanie wykryty. Also, due to the fact that RNA is usually single-stranded, it creates complex secondary structures which affect its migration and hence denaturing conditions are used to run the gels (unlike Southern). Ponadto, ze względu na fakt, że RNA jest zazwyczaj single-stranded, tworzy skomplikowanych struktur wtórnych, które wpływają na jej migracji, a tym samym warunków skażania są wykorzystywane do uruchamiania żele (w odróżnieniu od południowej).

RNA is separated out by RNA gel electrophoresis (usually agarose gel electrophoresis), subsequent transfer to membrane, hybridization with probe, and finally detection. RNA jest oddzielone przez elektroforeza RNA (zazwyczaj elektroforezy na żelu agarozowym), późniejszego przekazania do membrany, hybrydyzacja z sondą, w końcu i wykrywania.

Similarly to Southern blotting, the hybridization probes may be DNA or RNA in northern blotting. Podobnie jak w Southern blotting, hybrydyzacja może być sond DNA lub RNA w północnej blotting.

A variant of the procedure known as the reverse northern blot was occasionally (although, infrequently) used. A wariant z procedurą, znany jako odwrotnej Hybrydyzacja northern był czasami (choć rzadko) używane. In this procedure, the substrate nucleic acid (that is affixed to the membrane) is a collection of isolated DNA fragments, and the probe is RNA extracted from a tissue and radioactively labelled. W tej procedurze, substratem kwasu nukleinowego (która jest przymocowana do membrany) jest zbiorem izolowanych fragmentów DNA i RNA sondy jest wyodrębniony z tkanek i oznakowane radioaktywnie.

The use of DNA microarrays that have come into widespread use in the late 1990s and early 2000s is more akin to the reverse procedure, in that they involve the use of isolated DNA fragments affixed to a substrate, and hybridization with a probe made from cellular RNA. Wykorzystanie DNA microarrays, które mają wejść w powszechnym użytku pod koniec lat 1990 i na początku 2000 r. jest bardziej zbliżony do odwrócenia procedury, w tym sensie, że wykorzystuje pojedyncze fragmenty DNA umieszczone na podłożu, i hybrydyzacji z sondą wykonane z RNA komórkowy . Thus the reverse procedure, though originally uncommon, enabled the one-at-a-time study of gene expression using northern analysis to evolve into gene expression profiling, in which many (possibly all) of the genes in an organism may have their expression monitored W ten sposób odwrócić procedurę, choć początkowo niezbyt często, pozwoliły na jeden-do-czas badania ekspresji genów za pomocą analizy północnej ewoluować do profilowania ekspresji genów, w których wiele (być może wszystkie) z genów w organizmie może mieć swoje wypowiedzi monitorowany

Applications of the Northern Blot Wnioski z Hybrydyzacja northern

Northern blots have been superceded in most areas by Real Time PCR and microarray approaches. Północnej blots zastąpiona została w większości dziedzin Real Time PCR i microarray podejść. It is not often used for clinical or diagnostic purposes. To nie jest często wykorzystywane do celów diagnostycznych lub klinicznych.

The northern blot protocol and its variations are used however in molecular biology research to: W Hybrydyzacja northern Protokół i jego odmiany stosowane są jednak w biologii molekularnej do badań:

• a gold-standard for the direct study of gene expression at the level of mRNA (messenger RNA transcripts). złoty standard dla bezpośredniego badania ekspresji genów na poziomie mRNA (MRNA transkrypcje).
• detection of mRNA transcript size wykrywanie rozmiaru transkrypcję mRNA
• study RNA degradation badania degradacji RNA
• study RNA splicing - can detect alternatively spliced transcripts Badanie RNA zaplatania - alternatywnie można wykryć spliced transkrypcje
• study RNA half-life Badanie RNA półtrwania
• study IRES (internal ribosomal entry site) - to remove possibility of RNA digestion vs 2nd cistron translation. Badanie IRES (internal ribosomal entry site) - usunięcie możliwości trawienia RNA vs 2-te Cistron tłumaczenia.
• often used to confirm and check transgenic / knockout mice (animals) często używany w celu potwierdzenia i sprawdź transgenicznych / knockout mice (zwierzęta)

Disadvantages of Northern Blotting Wady Northern blotting

The disadvantages of using northern blotting include: W wady korzystania z północnej blotting obejmują:

• Often radioactivity is used. Często jest używany radioaktywności. This prevents ease of performing it, use and disposal. Zapobiega to łatwość wykonywania, użytkowania i usuwania. New methods of non-radioactive detection have been generated allowing non-radioactive detection. Nowe metody wykrywania radioaktywnych nie zostały wygenerowane umożliwiający wykrywanie nie-radioaktywne. See Pierce. Zobacz Pierce.
• The whole process of northern blotting takes a long time usually, from sample preparation through to detection. Cały proces północnej blotting zabiera dużo czasu zwykle, od przygotowania próbki poprzez wykrywanie.
• If RNA samples are even slightly degraded by RNases, the quality of the data and quantitation of expression is quite negatively affected. Jeśli próbki RNA są nawet nieco zdegradowanych przez RNases, jakości danych i ilościowego wypowiedzi jest dość negatywny wpływ.
• The standard northern blot method is relatively less sensitive than nuclease protection assays and RT-PCR. Standardowe Hybrydyzacja northern metoda jest stosunkowo mniej czułe niż testy nukleazy ochrony i RT-PCR. The sensitivity of northern blots may be increased with the use of nylon positively-charged membranes, use of a highly specific antisense probe. Czułość północnej blots może zostać zwiększona z korzystaniem z nylonu pozytywnie-opłata membrany, wykorzystanie wysoce specyficznych antysensowych sondy.
• Detection with multiple probes is a problem. Wykrywanie z wielu sond jest problem. Often, the membranes must be stripped before hybridization and detection with a second probe. Często, membrany muszą być usunięte przed hybrydyzacji i detekcji z drugiej sondy. This is a problem as harsh conditions are required to strip off probes from the blot and is also time consuming. To jest problem w trudnych warunkach są zobowiązane do obetniesz sond z Hybrydyzacja i jest czasochłonne. Also, there is a limit to the amount of times a blot may be stripped. Ponadto, istnieje ograniczenie do kwoty razy Hybrydyzacja może być usuwana.

Advantages of Northern Blotting Zalety Northern blotting

The advantages of northern blots include: Korzyści płynące z północy blots obejmują:

• It is a widely accepted and well regarded method Jest to powszechnie akceptowane i traktowane również metody
• northern blotting is a straight-forward method północnej blotting jest prosta metoda
• Often it is used as a confirmation or check Często jest on wykorzystywany jako potwierdzenia lub sprawdzenia
• Often a gold-standard Często złoty standard
• it is a versatile protocol as it can allow the usage of many types of probes (vs Real time PCR) including: radiolabeled and non-radiolabeled, in vitro transcribed RNA and even oligonucleotides such as primers. Jest to wszechstronny, jak protokół może zezwolić na korzystanie z wielu rodzajów sond (vs PCR w czasie rzeczywistym), w tym: radiolabeled i non-radiolabeled, przepisywane RNA in vitro, a nawet oligonucleotides, takie jak pierwsze.
• Sequences with even partial homology, unlike real time PCR or other methods can be used as hybridization probes (ie sequence from different species for homology analysis, or even genomic fragments can be used). Sekwencje z homology nawet częściowe, w odróżnieniu od PCR w czasie rzeczywistym lub inne metody mogą być stosowane jako sondy hybrydyzacji (tzn. sekwencji z różnych gatunków homology do analizy, lub nawet fragmentów genomu może być używany).

Northern Blot Protocol Hybrydyzacja northern Protokół

As mentioned the steps in northern blotting include: Jak wspomniano kroki w północnej blotting obejmują:

1. RNA isolation Izolacji RNA
2. Gel electrophoresis of RNA for separation Elektroforeza RNA w separacji
3. Transfer to membrane (usually positively charged nylon as RNA is negatively charged) Transfer do membrany (zazwyczaj pozytywnie opłata nylonu jako negatywnie obciążony jest RNA)
4. Cross-linking of RNA to membrane (usually by UV-crosslinking or chemical means) Sieciowanie RNA do membrany (zwykle przez UV-sieciowania lub środków chemicznych)
5. Hybridization Hybrydyzacji
6. Detection Wykrywanie

Materials Needed for Northern Blot Protocol Materiały potrzebne do protokołu Hybrydyzacja northern

Buffer Recipes Bufor Recipes

20XSSPE (500 ml) 20XSSPE (500 ml)

• 3.6M NaCl : 105.2 g 3.6M NaCl: 105,2 g
• 0. 2M phosphate buffer pH 7.0: 100mL of 1M 2M buforze fosforanowym o pH 7,0: 100ml z 1M
• 20mM EDTA: 20mL of 0.5M 20mm EDTA: 20 ml z 0.5M

Phosphate buffer pH7.0 (500ml) Buforze fosforanowym pH7.0 (500ml)

• NaH2PO4 (monobasic) 140 mL of 1M NaH2PO4 (jednozasadowy) 140 ml 1M
• Na2H2PO4 (Dibasic) 360 mL of 1M Na2H2PO4 (dwuzasadowy) 360 ml 1M
• pH to 7.0 after both are added pH 7,0 po obu dodaje

Hybridization buffer =HB (100mls) Bufor do hybrydyzacji = HB (100mls)

• 5X SSPE: 25mls 20X 5X SSPE: 25mls 20X
• 2% SDS: 20 mls 10% 2% SDS: 20 mls 10%

* *Right before using add 1000ug denatured RNAse free CT DNA (heat to 95o for 3 min to denature) 5000ug yeast RNA * * Prawo przed użyciem dodać 1000ug denaturację DNA RNAse wolne CT (ciepła do 95o do 3 min do denaturacji) 5000ug drożdży RNA

WASH: 2X SSPE + 0.1% SDS (500 mls) 50 mls 20X 5 mls 10% SDS= 0.1% SDS WASH: 2x SSPE SDS + 0,1% (500 mls) 50 mls mls 20X 5 SDS 10% = 0,1% SDS

Running buffer for RNA gel (1L) Kolejny bufor dla RNA żelu (1L)

• 100 mls 10X MOPS 100 mls 10X MOPS
• 52. 6 mls of formaldehyde 6 mls formaldehydu
• 847. 4 mls H20 4 mls H20

RNA Gel (70ml) RNA Gel (70ml)

• 0.84 g agarose 0,84 g agarozy
• 7 mls 10x MOPS 7 mls 10x MOPS
• 58.38 mls H2O 58,38 mls H2O
• Put gel in solution by heating. Umieścić żel w roztworze przez ogrzewanie. Let gel cool to 60°C, then add Formaldehyde to equal 0.66M --3.78 mls Niech żel schłodzić do 60 ° C, następnie dodać formaldehydu do równego 0.66M - 3,78 mls
• Pour gel in fume hood if possible Pour żel opary w kaptur jeśli to możliwe

RNA Samples for Northern Blot RNA dla próbek Hybrydyzacja northern

See RNA Isolation and Purification Zobacz RNA Izolacja i oczyszczanie

RNA Gel RNA Gel

After isolating RNA, the RNA must be separated out on a gel (usually agarose). Po izolowanie RNA, RNA musi być oddzielony na żelu (zazwyczaj agarozy).

see RNA gels zobacz RNA żele

Northern Blot Transfer to Nylon Membrane Protocol Hybrydyzacja northern Transfer do protokołu Nylon Membrane

After running the RNA gel , wash the gel with distilled water put on posiblotter. Po uruchomieniu RNA żel, żel do mycia w wodzie destylowanej umieścić na posiblotter.

Layers from top to bottom are: Warstwy od góry do dołu są:

• sponge gąbki
• 3-4 Whatman papers cut to size ( both of these up above should be soaked in 10X SSPE but not dripping) 3-4 Whatman kart cięte na wymiar (w obu wspomnianych powyżej powinny być moczony w 10X SSPE, lecz nie ociekania)
• gel mask. żel maska.
• Note: Make sure the gel overlays the mask so that it can seal membrane with line of the top of gel and the right top corner marked 3 pieces slightly bigger 3M paper hard plastic with holes Uwaga: Upewnij się, że żel nakładek maski, tak aby mógł on Pieczęć membrana z linii góry żel i prawo górnym rogu oznaczony 3 kawałki nieco większe 3M papieru twardego plastiku z dziurami

Clamp on and make sure there is a good seal. Clamp i upewnij się, że nie jest dobrym zamknięciem. Use 75-80 mm Hg of pressure for 1 hr or more. Korzystanie 75-80 mm Hg dla ciśnienia lub więcej 1 godz.

Blot membrane dry Blot suchej membrany

Cross-linking Nylon Membranes - Northern Blot Protocol Sieciowanie Nylon Membrany - Northern Blot Protokół

• Cut top right corner wrap in saran wrap. Cut prawym górnym rogu zawijać w Saran zawijania.
• UV irradiate with RNA side down for 2.5 min. UV naświetlić z RNA strony w dół do 2,5 min.
• Wash for a couple of minutes in hot 2X SSPE/0.1% SDS solution (Microwave solution for 30-45 seconds at 50% power. Umyć na kilka minut w gorącej 2X SSPE/0.1% roztworu SDS (Mikrofalowa roztworu do 30-45 sekund na 50% mocy.
• Air dry Wysuszyć

Pre Hybridization for Northern Blot Przedpłata na hybrydyzacji Northern Blot

1. Pre Hybridize for 6 hours-overnight Pre krzyżowały do 6 godzin-overnight
2. Set oven to 65°C heat HB buffer to put SDS in solution Ustaw piekarnik do 65 ° C ciepła HB bufor umieścić w roztworze SDS
3. Roll up membrane inside piece of mesh and put into hybridizaton tube(2X SSPE/0.1%SDS) Roll up membrany wewnątrz kawałek siatki i umieścić w probówce hybridizaton (2X SSPE/0.1% SDS)
4. Check for air bubbles Link do pęcherzyków powietrza
5. Put tube in oven balanced with another tube on opposite side Umieścić rurkę w piecu zrównoważony z innej probówce na po przeciwnej stronie

Labeling probe for Northern Blotting Oznakowanie sondy Północnej blotting

1. Put 25ng of probe in a total volume of 11uL with ddH2O Umieść 25ng z sondy w całkowitej objętości 11uL z ddH2O
2. Denature @ 95°C 3 min. Denaturacji @ 95 ° C 3 min. This is to get the probe single stranded and remove secondary structure which would prevent efficient hybridization. To jest uzyskanie sondy jednym osieroconych i usunąć wtórne struktury, które uniemożliwiałyby efektywne hybrydyzacji.
3. Quick cool on wet ice. Szybkie cool na mokrym lodzie. This is to keep the probe single stranded, free of secondary structure and not allow reannealing (or reforming of secondary structures). Ma to na celu utrzymanie sondy jednym osieroconych, wolne od konstrukcji i nie pozwalają reannealing (czy też w reformowaniu struktur wtórnych).
4. Add 4ul High Prime (Boehringer Mannheim) 5ul alpha radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul total Dodaj 4ul High premiera (Boehringer Mannheim) 5ul alfa radiolabeled P-32 dCTP 3000uCi/mmole 20ul całkowita
5. Incubate 10-15 min 37°C Inkubować 10-15 min 37 ° C
6. Add 28uL of 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, to 20ul reaction. Dodaj 28uL 1X TE, 2ul 0.5M EDTA, 20ul reakcji.
7. Pre-spin G-25 Sephadex column for 1 minute. Pre-spin Sephadex G-25 kolumna do 1 minuty.
8. Add 50ul sample to column and spin for 2.5 min in clinical centrifuge. Dodaj 50ul próbki do kolumny i spin do 2,5 min w klinicznych wirować. This is to purify probe away from label. Ma to na celu oczyścić sondę z dala od etykiety.
9. Throw away column. Throw away kolumnie.
10. Mix in a new tube 100ug CT-DNA 50ug Yeast RNA in a 0.5mL tube. Mix w nowej probówki 100ug CT-DNA, RNA 50ug drożdże w 0,5 ml probówce.
11. Denature 95° 3 min Denaturacji 95 ° 3 min
12. Add to hybrid tube mix, hybridize at 65°C for 20-36 hrs Dodaj do hybrydowych probówki wymieszać, krzyżowały przy 65 ° C przez 20-36 godzin

Post hybridization Protocol for Northern Blotting Post Protokołu do hybrydyzacji Northern blotting

Hybridize for 36-48 hours then wash. Krzyżowały do 36-48 godzin następnie umyć.

1. Heat up 2X SSPE/0.1% SDS (wash) heat up to 65° C (Use microwave or water bath to warm solution) Podgrzewać na 2X SSPE/0.1% SDS (zmywanie) ciepła do 65 ° C (Użyj mikrofalowych lub łaźni wodnej do ciepłego roztworu)
2. Take out tube and pour liquid into hot radioactive waste container. Zapoznaj się rurki i wlać płyn do pojemnika na gorąco odpadów radioaktywnych.
3. Rinse with 10ml wash do this twice and pour waste out. Spłukać 10ml umyć to zrobić dwa razy i dla odpadów.
4. Put in 40 to 50 mls of wash and shake vigoursly. Umieść w 40 do 50 mls do mycia i wstrząsnąć vigoursly.
5. Put in hybridization oven for 20 min rotating. Umieść w hybrydyzacji piec przez 20 min wirujących.
6. Pour down sink Pour dół umywalka
7. Another 40-50mls and shake in oven. Inny 40-50mls i wstrząsnąć w piecu.
8. Pour out to waste container (sink if not hot or toxic) and make sure it is no longer hot and then take out membrane. Wylej na pojemniki na odpady (umywalka, jeśli nie na gorąco lub toksyczne) i upewnić się, że nie jest już gorąco a następnie podejmuje się membrany.
9. Wash on shaker with 0.2XSSPE w/ 0.1% SDS at RT for 15 min. Umyć na wytrząsarce z 0.2XSSPE w / 0,1% SDS w PR za 15 min.
10. Air dry Wysuszyć
11. Expose

Tips for Northern Blot Porady dla Hybrydyzacja northern

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Jeśli mają obecnie preferowaną metodą izolowania RNA, nadal z niego korzystać.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Zawsze uruchomić żelu agarozowym swojego RNA do oceny jakości. Do not only rely on spectrophotometry results. Nie tylko polegać na wynikach Spektrofotometria.

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Używaj DEPC traktowane wody i pieczone szkła. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. To rozwiązanie, absolutnie pozytywny, muszą być wolne Rnase. Rnase is everywhere! Rnase jest wszędzie! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Założyć rękawice, należy użyć tylko pieczone szkła, tworzywa sztucznego lub z pierwszego tłoczenia. DePC treat your water, buffers (except Tris). DePC leczeniu woda, bufory (z wyjątkiem Tris). Be very careful. Trzeba być bardzo ostrożnym.

Troubleshooting Northern Blots Rozwiązywanie problemów Północnej Blots

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Jeśli mają obecnie preferowaną metodą izolowania RNA, nadal z niego korzystać.

Discuss and post questions about this in the Northern Blot Forum . Po dyskusji i pytania na temat tego w Hybrydyzacja northern Forum.

Northern Blot References Hybrydyzacja northern Referencje

1. Alwine JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). Astoria JC, Kemp DJ, Stark GR (1977). "Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenzyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes". "Metoda wykrywania specyficznych RNAs w żelu agarozowym w drodze przeniesienia na papier i diazobenzyloxymethyl hybrydyzacji DNA sondy". Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (12): 5350-4. USA 74 (12): 5350-4.
2. W. Neal Burnette (April 1981). W. Neal Burnette (kwiecień 1981). "'Western blotting': electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate — polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A". "Western blotting": transferu elektroforetycznego białek z dodecylo siarczanu sodu - żelu poliakrylamidowym do niemodyfikowanych nitroceluloza i radiologicznych wykrywanie przeciwciał i radioiodinated z białka ". Anal Biochem 112 (2): 195-203. Anal Biochem 112 (2): 195-203.