Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protokoły

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkty

Western Blot Books Western Blot Książki

Western Blot Troubleshooting Western Blot Rozwiązywanie problemów

Western Blot Books Western Blot Książki

See also: Related Links to External Sites: Western Blot Zobacz także: Pokrewne linki do zewnętrznych stron internetowych: Western Blot

Western Blot Western Blot

AUDIO : Listen to a detailed Western Blot Explanation ! Courtesy: National Human Genome Research Institute. AUDIO: Słuchaj szczegółowe Western Blot Wyjaśnienie! Uprzejmości: National Human Genome Research Institute.

Western Blot Definition: Western blotting is a technique used to identify and locate proteins based on their ability to bind to specific antibodies. Western Blot Definicja: Western blotting jest technika używana do identyfikacji i zlokalizowania białek w oparciu o ich zdolność do wiązania się do specyficznych przeciwciał.

Western blot analysis can detect your protein of interest from a mixture of a great number of proteins.  Western blotting can give you information about the size of your protein (with comparison to a size marker or ladder in kDa), and also give you information on protein expression (with comparison to a control such as untreated sample or another cell type or tissue). Western blot analiza może wykryć białko odsetki od mieszaniny wiele białek. Western blotting można uzyskać informacje na temat rozmiaru białka (w porównaniu do rozmiaru znacznika lub drabiny w kDa), a także zawiera informacje na temat ekspresji białka (w porównaniu do kontroli, takich jak próbki nieprzetworzonej lub innego rodzaju komórki lub tkanki).

Summary: Western Blot Gives You Information on the: Podsumowanie: Western Blot zawiera informacje na temat:

Western blot analysis can analyze any protein sample whether from cells or tissues, but also can analyze recombinant proteins synthesized in vitro. Western blot is dependent on the quality of antibody you use to probe for your protein of interest, and how specific it is for this protein. Antibodies are now easily obtainable from commercial sources, and you can purchase one for your protein of interest. Western blot analizy można analizować wszelkie próby, czy białka z komórek lub tkanek, ale również można analizować rekombinowanych białek syntezy in vitro. Western blot zależy od jakości przeciwciało korzystanie z sondy za białka interesów, jak i specyficzne dla tego jest białka. Przeciwciała są teraz łatwo uzyskana ze źródeł komercyjnych, a możesz kupić dla swojego białka zainteresowania. If your protein is a novel protein, you must produce an antibody yourself or get a company to do it for you. Jeśli białka jest powieść białka, musisz przedstawić siebie lub przeciwciała uzyskać firma zrobi to za Ciebie. In this case you will need at least a small amount of your protein either purified from cell extracts or made as a recombinant (ie in vitro or in a recombinant protein expression system ). Antibodies specific to your protein are vital to western blotting as they are able to bind specifically to your protein of interest instead of the thousands of proteins on your western blot! W tym przypadku będziesz musiał przynajmniej niewielką ilość białka w Twojej komórce bądź oczyszczony z ekstraktów lub wykonane jako rekombinowane (czyli in vitro lub w systemie ekspresji rekombinowanych białek). Przeciwciała specyficzne dla danego białka są niezbędne do zachodnich blotting jak są one możliwość wiązania białka specjalnie do Twoich interesów zamiast tysięcy białek na swojej zachodniej Hybrydyzacja!

Figure 1. Rysunek 1. Details of the steps involved in obtaining protein for western blot. Szczegóły dotyczące kroków w celu uzyskania dla Western blot białka.

Figure 2. Rysunek 2. Figure detailing the steps in conducting a western blot. Rysunek szczegółowo kroki w prowadzeniu western blot.

[ Top ] [Top]

How Does Western Blotting Work? Czy Western blotting Jak działa?

See Diagram 1 below. Patrz wykres 1 poniżej. First things first. Najpierw rzeczy. Obtain a protein sample you want to analyze, such as cell samples. Uzyskaj białka chcesz próbki do analizy, takie jak komórki próbek. Lyse the cells to release protein contents. Lyse komórki do uwolnienia zawartości białka. Run these on a gel which separates proteins on the basis of size. Uruchom te na żel, który oddziela białek na podstawie ich wielkości. Then transfer these gel proteins onto a membrane using electricity. Następnie transfer tych białek na żelu membranowy przy użyciu energii elektrycznej. This membrane can then be used to probe for proteins of interest using a primary antibody. Ta membrana może być następnie wykorzystane do sondy do białek interesów za pomocą przeciwciał pierwotnych.

What You Need to Western Blot: Co musisz Western Blot:

Western blot relies on the primary antibody to detect this protein from the thousands of proteins on your membrane and previously on your gel! Western blot opiera się na podstawowym celu wykrycia przeciwciał tego białka z tysięcy białek w Twoim membrany i wcześniej w Twoim żel! (a cell can contain 30,000 different proteins - and these same proteins can even be altered giving you over 300,000 different proteins!). (komórka może zawierać 30000 różnych białek - i tych samych białek może nawet ulec zmianie dając ponad 300000 różnych białek). Using an antibody recognizes your primary antibody (a secondary antibody) you build up a protein-antibody-antibody sandwich!  The secondary antibody has a horse radish peroxidase enzyme which converts a luminol substrate to a light releasing substance! Korzystanie z przeciwciało rozpoznaje swoje pierwotne przeciwciała (przeciwciała wtórne) można zbudować białko-przeciwciało-przeciwciało sandwich! Wtórne przeciwciało ma konia Rzodkiew peroksydazy enzymu, która przekształca Luminol substrat do uwolnienia substancji światła! This light is detected as a spot on film. To światło jest wykrywany jako miejscu na filmie. From this spot you can determine how much protein is there relative to other spots, or the size of the protein relative to a size marker that is run also on the gel. Od tego miejscu można ustalić, ile jest tam białka w stosunku do innych miejscach, lub rozmiar białka w stosunku do wielkości, który jest uruchamiany również na żel.

Diagram 2 shows a western blot example gel. Wykres 2 pokazuje, western blot przykład żel. Lane 1 is a protein size marker ladder which shows different known sizes of proteins, this can be purchased commercially and the sizes of all the spots are given in a pamphlet. Lane 1 jest białkiem rozmiaru znacznika drabiny, która pokazuje różne rozmiary znanych białek, może to być zakupione komercyjnie i rozmiary wszystkich miejscach są podane w pamphlet. Lane 3 is a cancer sample and lane 5 is a normal sample. Lane 3 jest rak i próby Lane 5 jest normalne próby. As you can see the protein in lane 3 has a higher expression than the cancer sample in lane 5, which is interesting. Jak widać białka w pasie 3 ma wyższy niż rak wypowiedzi próbki w pasie 5, który jest interesujący. Also, the protein spots in lanes 3 and 5 are the same size as the 2nd spot in the size ladder from lane 1. Ponadto, białko spoty w pasy 3 i 5 są takie same jak rozmiar 2 miejscu w rozmiarze drabiny z pasa 1. We can then look at the known protein size from our brochure which we received with the ladder. Możemy następnie spojrzenie na znane od wielkości białka naszą broszurę, które otrzymaliśmy z drabiny. We then determine that the size of the protein is 80 kDa. Następnie ustalić, że wielkość białka wynosi 80 kDa. Our protein of interest is also 80 kDa. Nasze białka zainteresowania jest również 80 kDa. So we know that the western blot worked and that the protein is highly expressed in a cancer sample! Więc wiemy, że w zachodniej Hybrydyzacja pracował i że białka jest bardzo wyrażone w próbce raka!

To Detect your Protein: Aby wykryć białka:

[ Top ] [Top]

Diagram 1. Diagram 2. Wykres 1. Wykres 2.

Now Learn everything else there is about western blots! Dowiedz się, teraz wszystko inne jest ok. zachodnich blots!

[ Top ] [Top]

Table of Contents , in order done for western blot: Spis treści, w celu zrobienia dla zachodnich wytracenia:

Steps in Western Blotting : Kroki w Western blotting:

- Preparing for Western Blot -- Przygotowanie do Western Blot

- Which Antibody to use for Western Blots -- Jakie przeciwciała do wykorzystania dla Western Blots

- Lysing Cells for Western Blot -- Lizy komórek Western Blot

- SDS-PAGE Gel Information -- SDS-PAGE Gel Informacje

- SDS-PAGE Gel Preparation for Western Blots -- SDS-PAGE Gel Przygotowanie Western Blots

- Gel Electrophoresis - running the gel -- Elektroforeza - działa na żel

- Tranfer of Proteins to Membrane for Western Blotting -- Transfer białek z membrany dla Western blotting

- Western Blot -- Western Blot

Terms and Definitions used in Western Blot Analysis Terminy i definicje używanych w Western Blot Analiza

Latest Western Blot Topics ! Najnowsze Tematy Western Blot!

[ Top ] [Top]

Steps in Western Blot Analysis: Kroki w Western Blot Analiza:

- Sample Prepartation -- Przykładowe Prepartation

- Lysing Buffer -- Roztwór buforowy

- Antibody -- Przeciwciało

- Lysing Cells -- Lizy komórek

- Gel Preparation -- Przygotowanie Gel

- Running Gel -- Running Gel

- Transfer of Gel -- Przesunięcie Gel

- Controls -- Kontrole

- Western Blot -- Western Blot

- Readout -- Odczytu

- Analysis and Interpretation -- Analiza i interpretacja

[ Top ] [Top]

To Prepare Samples for Western Blot: Do przygotowania próbki do Western Blot:

Whether you have Non-adherent Cells (such as T-cell lines or peripheral blood cells) or Adherent cells (such as Fibroblast cells or COS cells), you need to remove extraneous proteins from the media. Niezależnie od tego, czy masz niezrośnięta komórek (np. komórek T lub linii komórek krwi obwodowej) lub Adherent komórek (np. Fibroblast komórki lub komórek COS), musisz usunąć obce białka z mediów. For non-adherent cells you can gently pellet them with centrifugation and then wash the pellet with PBS. Dla niezrośnięta komórek można delikatnie osadu z nich odwirowanie, a następnie umyć osad w PBS. For adherent cells, simple wash the flask or dish with PBS prior to western blot. Na przylegających komórek, proste umyć kolbę lub naczynia z PBS przed zachodnich blot.

Western blot analysis examines proteins, and so we want the proteins to be release from the cells and also prevent the proteins from being cut up by proteases. Western blot analiza białek, a więc chcemy białek do uwolnienia się od komórki, a także zapobieżenia z białkami są rozbierane przez proteazy. We need these to western blot: Musimy do tych zachodnich wytracenia:

- to keep things cold! -- Zachować zimną rzeczy! 4C on ice during cell lysis for western blotting 4C na lodzie podczas lizy komórki dla zachodnich blotting

- use Detergent to break up membranes of cells to release proteins -- Stosowanie detergentów, aby rozbić membrany komórek do uwolnienia białek

- Buffer -- Buforowych

- Inhibitors (both protease inhibitors and phosphatase inhibitors if we will do western blot for phospho-proteins) -- Inhibitory (inhibitory proteazy, jak i inhibitorów fosfatazy, jeśli będziemy robić zachodnich fosforan-blot dla białek)

Detergent - Lysing Cells For Western Blot Detergentów - lizy komórek Western Blot

SDS and RIPA are detergents that are used to solubilize proteins for later analysis using western blotting. SDS Ripa i detergentów, które są wykorzystywane do solubilize białek do późniejszej analizy za pomocą zachodnich blotting. This is required as many proteins are either inside the cell or located inside cell membranes, so we need to release these proteins to be able to immunoblot for them. Jest to wymagane w wielu białek są zarówno wewnątrz komórek lub znajdujących się wewnątrz komórek błony, więc musimy się do uwolnienia tych białek, aby móc immunoblot dla nich.

[ Top ] [Top]

Which Antibody should I use for Western Blotting? Przeciwciało Jakie powinno się użyć dla Western blotting?

You should select an Antibody to use for Western Blot. Usually either mouse monoclonal antibodies or rabbit polyclonal antibodies are used. Należy wybrać Przeciwciało do wykorzystania dla Western Blot. Zwykle albo mysz monoklonalne przeciwciała poliklonalne lub królik są używane.

You can use either an antibody without any added groups, or use an antibody which is conjugated to biotin. Można użyć albo przeciwciała bez dodanej grupy, lub skorzystać z przeciwciałem, które jest sprzężonymi do biotyna. These antibodies do not require Przeciwciała te nie wymagają

Polyclonal vs Monoclonal Antibodies for Western Blot Vs poliklonalne przeciwciała monoklonalne dla Western Blot

Monoclonal Antibodies are usually better for Western Blotting due to: Przeciwciała monoklonalne są zazwyczaj lepiej dla Western blotting z powodu:

- better signal to noise ratio ( lower background in western blot ) -- Lepszego sygnału do szumu (w tle w zachodnich niższe wytracenia)

- their higher specificity ( you get less contaminating proteins or Ig ) -- Wyższe ich specyfikę (Ci mniej zanieczyszczających białek lub IG)

- overall cleaner results on the western blotting film (less non-specific bands detected) -- Ogólna czystość wyników na zachodnim blotting film (nie mniej konkretnych częstotliwości wykrytych)

Polyclonal Antibodies are better suited for Immunoprecipitation: Przeciwciała poliklonalne są lepiej dostosowane do Immunoprecipitation:

- they recognize more epitopes -- Rozpoznaje więcej determinanty

- have higher avidity -- Posiadać wyższe awidności

[ Top ] [Top]

Lysing Cells for Western Blot: Lizy komórek Western Blot:

TIPS before you lyse for western blotting: ATRAKCJE przed lyse dla zachodnich blotting:

If you are going to western blot for protein mass (ie a protein that is not phosphorylated): Jeśli chcesz zachodnich Hybrydyzacja do masy białka (np. białko, iż nie jest fosforylacji):

- you can lyse in larger volumes (keeping the rest to blot for other proteins) -- Można lyse w dużych ilościach (przechowywanie pozostałej do wytracenia dla innych białek)

If you are going to western blot a phospho-protein (or phosphorylated protein) it is important to do the following: Jeśli chcesz zachodnich Hybrydyzacja fosforan jedno-białka (lub fosforylacji białka) ważne jest, aby wykonać następujące czynności:

- make sure you use phosphatase inhibitors ( such as vanadate because phosphatases will remove the phosphates from your proteins! ) -- Upewnij się, że inhibitory fosfatazy wykorzystania (np. fosfatazy vanadate ponieważ spowoduje usunięcie fosforanów z białek!)

- also lyse cells in the smallest volume possible ( ie lyse in 100 ul loading buffer, this is done because you can load most of the cells you lysed. This is important as signal is quite weak when western blotting for phospho-proteins.) -- Również lyse komórek w możliwie najmniejszej objętości (np. lyse w 100 ul ładowania bufor, to zrobić, ponieważ możesz załadować większość komórek jest właściwie rozłożona. Jest to ważne, ponieważ sygnał jest dość słaby, gdy na zachodnich blotting fosforan-protein).

If you are looking at protein-protein interactions : Jeśli szukasz w interakcje białko-białko:

- do not use SDS as it dissociates protein-protein interactions and thus proteins are denatured (especially after boiling) -- Nie używać go jako SDS dystansuje interakcje białko-białko, a zatem są denaturacji białka (zwłaszcza po gotowaniu)

- for western blotting protein-protein interactions, ie native interactions you must use a less-stringent detergent such RIPA. -- Dla zachodnich blotting interakcje białko-białko, czyli native interakcji należy użyć mniej rygorystyczne detergentu takich Ripa.

Lysing: Lizy:

- can be done directly on the plate or dish -- Można dokonać bezpośrednio na płytce lub anteny

- pellet the cells -- Osad z komórek

- Keep on Ice and cold - use an ice bucket -- Keep on Ice i zimno - korzystania z lodu wiadro

- Rule of thumb for how much lysis buffer to use is: 10^5 cells / uL of lysis buffer -- Zasad na ile bufor do lizy stosowanie jest: 10 ^ 5 komórek / uL do lizy bufor

- collect in eppendorf tubes and label ( keep these on ice ) -- Gromadzenie w Eppendorf rur i etykiety (zachowanie na lodzie)

Measure total protein before Western Blot Analysis: Środek łączna ilość białka przed Western Blot Analiza:

- this allows more quantitative analysis if you want to compare treatment conditions in western blot analysis -- Pozwala to więcej analiz ilościowych, jeśli chcesz porównać warunki leczenia w zachodniej Hybrydyzacja analizy

- commercial kits are available such as a Bradford assay for measuring total protein (from Bio-Rad) -- Zestawy są dostępne komercyjne, takie jak Bradford teście pomiaru białka ogółem (z Bio-Rad)

- 0.1% of SDS or greater can interfere with protein measurement -- 0,1% SDS lub większej mogą kolidować z białka pomiaru

Denature Protein Samples : Denaturacji białka Próbki:

- add protein loading sample buffer to an aliquot of cell lysate - contains dye (too see the migration on a gel, 2% SDS) -- Dodać białka ładowania bufor próbki do podwielokrotności komórki lysate - zawiera barwnik (patrz także migracji na żel, 2% SDS)

- add disulfide reducing agent such as beta - mercaptoethanol -- Dodaj disiarczek zmniejszenie agenta, takich jak beta - merkaptoetanolu

- Boil in water bath or heating block (lower temperatures such as mid - 90 degrees decrease protein aggregation ). -- Gotować w łaźni wodnej lub bloku ogrzewania (niższe temperatury, takich jak połowy - 90 stopni spadek agregacji białka).

- Poke a hole in cap of each tube to prevent popping -- Poke dziurę w każdej probówki z korkiem, aby zapobiec trzaskający

SDS-PAGE Gel Information for Western Blotting SDS-PAGE Gel Informacje dla Western blotting

SDS-PAGE Gels are gel matrices which are used to separate proteins by size in the presence of electric current. SDS-PAGE Żele są żel matryce, które są używane do oddzielenia białka wielkości w obecności prądu elektrycznego. Low percentage gels separate larger proteins whereas higher percentage gels separate smaller proteins better. Niski procent żele odrębnych większych białek mając na uwadze, że wyższy procent żele osobnych mniejszych białek lepiej. The problem is that all proteins have a charged associated with them, and in an electrical current this could cause problems. Problem polega na tym, że wszystkie białka mają pobierane z nimi, i elektrycznych w obecnych może to powodować problemy. This is solved by the addition of SDS to the protein samples. Jest to rozwiązane poprzez dodanie do białek SDS próbek. SDS binds to proteins every few amino acids and neutralizes the charge differences that proteins have. SDS wiąże się z białkami co kilka aminokwasów i neutralizuje opłaty różnic, które są białkami. This allows proteins to be separated by size and not by charge. Dzięki temu białka, które mają być rozdzielone według wielkości, a nie opłaty.

[ Top ] [Top]

SDS-PAGE Gel Preparation for Western Blot SDS-PAGE Gel Przygotowanie Western Blot

- depending on how much protein you will want to load for western blotting, you should use small combs or larger combs. -- W zależności od tego jak dużo białka będzie to obciążenie dla zachodnich blotting, należy użyć małych lub większych grzebienie grzebienie.

- the percentage of acrylamide is important. -- Procent akryloamid jest ważne. Usually 10% acrylamide is used. Zwykle 10% akrylamid jest używany.

- A resolving gel is used at the bottom with a pH of 8.8 -- Rozwiązywanie żel stosowany jest na dole o pH 8,8

- A stacking gel (4-5%) pH 6.8 is used to pack proteins in together after loading -- Stacking żelu (4-5%) pH 6,8 jest używany do pakowania białka w połączeniu po załadowaniu

- Polymerization of gels is increased by the catalysts APS and TEMED which speed up the polymerization reaction (formation and solidification) of the poly-acrylamide gel. -- Polimeryzacji żelu jest zwiększona przez katalizatory APS i TEMED które przyspieszenia reakcji polimeryzacji (tworzenie i zestalania) z poli-akryloamid żel.

- Load every Sample carefully and slowly to prevent sample leaking out of the lane. -- Obciążenia każdej próbki ostrożnie i powoli, aby zapobiec wyciekom próbki z pasa.

- Load every lane and use sample buffer in each (to prevent differences in ). -- Obciążenie każdego pasa ruchu i wykorzystanie bufora w każdej próby (aby zapobiec różnic).

[ Top ] [Top]

Gel Electrophoresis Elektroforeza

1. Centrifuge samples for 10 sec after boiling. Wiruj próbki przez 10 sekund po gotowaniu.
2. Load sample into each lane Załaduj próbki do każdego pasa
3. Load MW reference Załaduj MW odniesienia
4. Run gel at 100V (constant voltage) or even better at 40 mA (constant current). Uruchom żel na 100V (napięcie stałe) lub jeszcze lepiej na 40 mA (stałego prądu). Watch protein marker/ladder or dye front for when to stop gel. Patrz białka znacznika / barwnika lub drabiny do przodu, kiedy do zatrzymania żel. Constant current gives better and sharper results if you have the time. Stałego prądu daje lepsze wyniki i ostrzejszy, jeśli masz czas.

- watch for bubbles between glass and under the gel - this means that it is working -- Zegarek na szklanych baniek między i pod żel - oznacza to, że działa

- watch for protein migration (should be going down) - if not you have switched the leads and can lose all your samples! -- Zegarek dla migracji białek (powinny być zejście) - jeśli nie masz zmienił prowadzi i może utracić wszystkie próbki!

- Initially run slowly through the stacking gel (~ 50 Volts), this gives sharper bands. -- Początkowo powoli uruchomić poprzez stacking gel (~ 50 Volt), to daje ostrzejszy zespołów.

- Do not run overnight -- Nie od razu uruchomić

- Do not over-heat the gel (this causes the gel to lose rigidity, leading to poor resoloving and blurry badly formed bands) -- Czy nie zbyt ciepło żelu (powoduje to żel do utraty sztywności, co prowadzi do biednych resoloving i niewyraźne źle uformowane pasm)

[ Top ] [Top]

Tranfer of Proteins to Membrane for Western Blotting Transfer białek z membrany dla Western blotting

Select Membrane Type: Wybierz Membrana Typ:

Can use either: Czy można używać albo:

- PVDF membrane for western blots -- PVDF membrany dla zachodnich blots

- Nitrocellulose membrane for western blots -- Nitroceluloza membrany dla zachodnich blots

- Nylon membrane (rarely used now - can tear) -- Nylon membrana (obecnie rzadko używane - może rozerwaniem)

Tips for Transfering to Western Membrane: Porady dla Przesyłanie do zachodnich Membrana:

-Wear Gloves at all times! - Wear Rękawice na zawsze! Use forceps Użyj pęseta

- Minimize touching/forceps to the membrane -- Minimalizuj dotykania / pęseta do membrany

Bio-RAD transfer order: Bio-Rad transferu kolejności:

(-)
sponge on black Gąbka na czarno
filter paper bibuły filtracyjnej
gel nitrocellulose żel nitroceluloza
filter paper bibuły filtracyjnej
sponge gąbki
(+)

Transfer : Transfer:

- Keep cool in 4C -- Przechowywać w chłodnym 4C

- Transfer overnight at 35 V -- Przesunięcie w nocy na 35 V

- Can transfer quickly in 1 hour at higher V -- Czy przeniesienie szybko w 1 godzina na wyższy V

[ Top ] [Top]

Western Blot Western Blot

Blocking of Membranes allows you to maximize signal:noise ratio Blokowanie Membrany umożliwia maksymalizację sygnału: szum

- wear gloves -- Nosić rękawice

- Block with 5% Blotto (non-fat dry milk - powder) or 1 - 5% BSA (Bovine Serum Albumin) for phosphorylated proteins. -- Blok z 5% Blotto (suchej beztłuszczowej mleka - w proszku) lub 1 - 5% BSA (Bovine Serum Albumina) do fosforylacji białka.

- Buffer is TBST -- Bufor jest TBST

Washing After Blocking Mycie Po Blokowanie

- washing after blocking steps is not critical, as people often block during primary antibody incubations. -- Mycie po blokowanie czynności nie jest krytyczna, jak często ludzie blokują podczas inkubacji przeciwciał pierwotnych.

- washing is usually done with TBST buffer. -- Mycie jest zazwyczaj wykonane z bufor TBST. Can be done quickly with a large volume of TBST. Można zrobić szybko, z dużą ilością TBST.

Incubation with Primary Antibody Inkubacja z Primary Antibody

- mouse, rabbit or other species -- Myszy, królików i innych gatunków

- usually 1 : 1000 dilution with TBST -- Zazwyczaj 1: 1000 rozcieńczeniu z TBST

- if high background/many non-specific bands is a problem, incubations can be done with 5% BSA or Milk. -- Jeżeli wysokie tło / non-specific wielu zespołów jest problem, inkubacji można zrobić z 5% BSA lub mleka.

Washing after Primary Antibody Mycie po Primary Antibody

- not so critical -- Nie tak krytycznej

- can wash quickly with large volumes of TBST -- Można szybko umyć w dużej ilości TBST

Incubation of Secondary Antibody Inkubacja Secondary Antibody

- usually diluted 1 : 10, 000 with TBST -- Zazwyczaj rozcieńczone 1: 10 000 w TBST

- anti-mouse, anti-rabbit, or other antibody conjugated with HRP enzyme for detection -- Anty-mysz, anty-królik, lub inne przeciwciała związanej z HRP enzymu do wykrywania

Washing After Secondary Antibody Mycie Po Secondary Antibody

- CRITICAL -- KRYTYCZNE

- Wash 5 X for 5 minutes with TBST. -- Umyć 5 X do 5 minut z TBST.

- If you really must rush, wash at least 3 times with larger volumes of TBST. -- Jeśli naprawdę musi pędu, umyć co najmniej 3 razy większej ilości TBST.

Assaying for Results Wyniki na zbadanie

- usually ECL (Enhanced Chemiluminescence) is used -- Zazwyczaj ECL (Enhanced chemiluminescencja) jest używany

- film is exposed and developed. -- Film jest narażony i rozwiniętych. Exposure for 10 seconds is usually enough for total protein. Narażenie na 10 sekund jest zwykle wystarcza do całkowitego białka. Phospho-proteins can require 2 - 20 minute exposures. Fosforan-białka może wymagać 2 - 20 minut ekspozycji.

- film is usually XOMAT or similar 'fast' film -- Film jest zwykle XOMAT lub podobne "szybki" film

[ Top ] [Top]

See Troubleshooting Western Blot Zobacz Rozwiązywanie problemów Western Blot

Terms used in western blotting: Terminy stosowane w zachodnich blotting:

WB - western blot WB - zachodniej Hybrydyzacja

IB - immunoblot (another term for western blotting) IB - immunoblot (inny termin do zachodniej blotting)

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate (a detergent used in many western blotting solutions) SDS - dodecylo siarczanu sodu (detergenty używane w wielu zachodnich rozwiązań blotting)

PAGE - Polyacrilamide Gel Electrophoresis Page - Polyacrilamide elektroforeza

Ab - Antibody (antibodies are used to detect your protein of interest) Ab - przeciwciało (przeciwciała są używane do wykrywania białka swoje zainteresowania)

HRP - Horse Radish Peroxidase HRP - Jazda Rzodkiewka Peroxidase

Luminol - substrate that HRP cleaves to cause light formation Luminol - substrat, że HRP cleaves powodować lekkie formacji

ECL - Enhanced Chemiluminescence ( western blot solution which enhances light formation from HRP + Luminol) ECL - Wzmocniona chemiluminescencja (zachodnia Hybrydyzacja rozwiązanie, które zwiększa świetle formacji z HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (most proteins average between 30 - 80 kDa) kD / kDa - kilodalton (większość białek średnio od 30 - 80 kDa)

RAM - rabbit anti-mouse Ig RAM - Rabbit anti-Mouse Ig

Ig - Immunoglobulin(an antibody isotype) Ig - Immunoglobuliny (przeciwciała izotypach)

NP-40 - Nonidet P-40 NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride PMSF - phenylmethylsulfonyl fluorek

BSA - Bovine Serum Albumin BSA - albumina surowicy wołowej

NFDM - Non-fat dry Milk NFDM - suchej masy beztłuszczowej mleka

[ Top ] [Top]

[ Top ] [Top]