Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatyka, protokoły, DNA, RNA Białko Proteomika

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Strona główna Biologia protokoły bioinformatycznych narzędzi Biologia Forum Biologii Molekularnej Encyklopedia Biologii Molekularnej Obrazy Bookmark Us!

home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php Strona główna> białka> rozwiązywania problemów-zachodniej blots-> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Biologii Molekularnej Strona główna Wiadomości Nauka Nauka filmy DNA, RNA Białko Proteomika Badania BETA! Bioinformatics Lab Equipment Techniki Biologii Molekularnej Biologii Molekularnej produkty i usługi związane Biologia Linki

Molecular Biology Blog Biologii Molekularnej Blog

Send this page to a friend Wyślij tę stronę znajomemu

Intracellular Stations Stacje wewnątrzkomórkowa

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Przeciwciało Botanika Wspólnej Zderzaki Zderzaki Alfabetyczna Księgarnia Biologii Komórki i Kultury elektroforeza Histologii Microarrays Immunologia Spektrometrii Mas Mikrobiologii obrazowanie molekularne Peptide Proteomika Protein Microarray Chips PCR, Real-Time PCR RNAi i SiRNA Stem Cell Biology Transfekcja Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protokoły

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkty

Western Blot Books Western Blot Książki

Western Blot Troubleshooting Western Blot Rozwiązywanie problemów

Western Blot Books Western Blot Książki

Troubleshooting Western Blots Rozwiązywanie problemów Western Blots

The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! Molekularnym Station Przewodnik Western blotting problemy i rozwiązania: Western Blot wspólne problemy i rozwiązania dla nich!

Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Skontaktuj się z nami swoje pomysły, jeśli można dodać do tego przewodnika.

What is your western blot problem? - Organized Alphabetically Jaki jest Twój zachodnich Hybrydyzacja problem? - Organizowanie Alfabetycznie

Fuzzy Bands Fuzzy Zespoły

Low Signal Niski sygnał

Membrane is Glowing in the Dark Room Membrana jest Glowing in the Dark Room

High Background Wysoki

Spots on Film Film na spoty

Too many Bands in Western Blot Zbyt wiele w Western Blot Zespoły

Weak Signal Słaby sygnał

Troubleshooting Western Blots Problem: Rozwiązywanie problemów Western Blots Problem:

Spots on Film (missing bands) : Miejsca na film (brakuje pasm):

- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Poor transferu ze względu na pęcherzyki powietrza podczas transferu do membrany

- dirty film when adding to the developer -- Dirty film podczas dodawania do dewelopera

- developer rolls are dirty -- Deweloper rolkach są brudne

Solution to spots on film: Rozwiązanie plamy na film:

- use a pasteur pipette as a roller. -- Korzystania z pipety Pasteura jako wałka. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. rolki membrany i żel do przeniesienia do usuwania pęcherzyków. keep membrane and materials wet. zachować membrany i materiały wilgotne.

- keep film clean before adding to the developer -- Zachować czyste filmu przed dodaniem do dewelopera

Troubleshooting Western Blots Problem: Rozwiązywanie problemów Western Blots Problem:

Too Many Bands in Western Blot : Too Many Bands w Western Blot:

- usually due to many non-specific bands -- Zazwyczaj z powodu braku wielu konkretnych częstotliwości

- poor primary antibody quality or old antibody -- Poor Primary Antibody jakości lub starych przeciwciało

- not enough blocking -- Nie wystarczy zablokowania

- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytic cleavage antygenu - wszystkich dodatkowych pasm MW są niższe niż białka, (tj. białka jest wykrywane ale zdegradowanych)

Solutions to too many bands on western blot: Rozwiązania do zbyt wielu zespołów na zachodnich wytracenia:

- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Zakup lub zastąpić innym przeciwciał w stanie świeżym przeciwciało

- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Blok z 5% suchej beztłuszczowej mleka lub BSA przed dodaniem podstawowej. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Jeśli jesteś już blokuje, należy rozważyć blokowanie podczas pierwotnego i wtórnego inkubacji przeciwciał, a także zwiększenie blokowania mleka lub BSA koncentracji.

- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Zachować wszystko, co na lód, należy użyć świeżych próbek, w magazynie - 80C, wykorzystania i inhibitory proteazy, takie jak PMSF

Troubleshooting Western Blots Problem: Rozwiązywanie problemów Western Blots Problem:

High background; low signal to noise ratio on Western Blot Wysokie tło; niskiego sygnału do szumu na Western Blot

- black or every dark film; film was exposed too long -- Czarny lub ciemny każdym filmie, film był zbyt długi narażone

- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blokowanie było niewystarczające; wiązania niespecyficznego przeciwciał pierwotnych i wtórnych przeciwciał nie były myte całkowicie

- washing was insufficient -- Mycie było niewystarczające

- film glows in dark! -- Film glows w ciemności! - too high secondary or primary dilutions -- Zbyt wysokie wtórne lub pierwotne rozcieńczeń

Solutions to Dark Film: Rozwiązania Dark Film:

- expose for less time, decrease exposure time -- Wystawiać mniej czasu, zmniejszenie czasu ekspozycji

- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Zwiększyć czas blokowania beztłuszczowej mleka, 5% suchej inkubacji lub zwiększenie stężenia.

- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Można również spróbować blokowanie z całego surowicy zwierząt z hosta (lub przed) przeciwciało wtórne

- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Zwiększenie wielkości i mycia razy, aby pomóc usunąć bez żadnych konkretnych sygnałów ze względu na słabe przeciwciała wiążące.

- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Przy użyciu detergentów do mycia silniejszy - Zamiast TBST (Tween 20), użyć mocniejszego detergentów, takich jak NP-40 lub SDS, który może zapewnić bardziej rygorystyczne umyć i zmniejszyć tło (to zrobić tylko wtedy, gdy zespół jest silny! - Mycie również usuwa niektóre pasma Twoich interesów!)

- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Bardzo wysokie przeciwciała wtórne (lub nawet podstawowej) koncentracji - wykonywanie optymalizacji eksperymentów w celu określenia właściwego rozcieńczenia przeciwciał. dilute the antibodies further. rozcieńczonego przeciwciała dalej.

Troubleshooting Western Blots Problem: Rozwiązywanie problemów Western Blots Problem:

Low Signal or Weak Signal Niski sygnał lub Słaby sygnał

- due to not enough protein loaded on the gel -- Ze względu na mało białka załadowane na żel

- primary antibody is old or not good -- Pierwotne przeciwciało jest stary, czy nie dobry

- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Fosforan-białka zwykle trzeba od razu podstawowej inkubacji

- not enough secondary antibody -- Nie wystarczy wtórne przeciwciało

- over-blocking -- Nadmierne blokowanie

- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Opracowanie odczynniki są złe / użytkownik popełnił błąd, przygotowując ich

Solutions to Low Signal or Weak Signal : Rozwiązania do niskiego sygnału lub słabych sygnałów:

- load more protein sample onto gel -- Obciążenie więcej białka próbki na żel

- try fresh primary antibody -- Spróbować świeżego Primary Antibody

- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Inkubować Primary Antibody overnite dla phosphoproteins na 4 stopni C (chłodni shaker)

- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Wzrost stężenia białka (lyse mniej lizy próbek w buforze)

- decrease concentration of blocking agent -- Zmniejszenie stężenia czynnika blokującego

- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Sprawdzić odczynniki rozwijających się; przygotowania świeżych i re-ECL ECL membrany

- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Zwiększenie stężenia lub pierwotnej długości okresu inkubacji

- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Zwiększenie stężenia lub długości okresu inkubacji przeciwciało wtórne

Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy Kapele, zespoły Smeared, zespoły nie Sharp

- bands smeared due to hot gel -- Zespoły smeared ze względu na gorąco żel

- bands fuzzy due to high voltage -- Zespoły fuzzy z powodu wysokiego napięcia

Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Rozwiązania Fuzzy zespołów i ONZ-ostre zespoły:

- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Spadek napięcia lub prądu, uruchomić w chłodni, przygotowania i uruchomienie nowego bufora. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Ciepło powoduje, że żel do stracenia jej sztywność i moc jego rozwiązaniu)

- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-zanurzenia transferu membrana w odpowiednim rozwiązaniem przeniesienia (określane przez producenta membrany) do wymaganego czasu.