Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatyka, protokoły, DNA, RNA Białko Proteomika

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Strona główna Biologia protokoły bioinformatycznych narzędzi Biologia Forum Biologii Molekularnej Encyklopedia Biologii Molekularnej Obrazy Bookmark Us!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php Strona główna> białka> białka protokołów> Western-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Biologii Molekularnej Strona główna Wiadomości Nauka Nauka filmy DNA, RNA Białko Proteomika Badania BETA! Bioinformatics Lab Equipment Techniki Biologii Molekularnej Biologii Molekularnej produkty i usługi związane Biologia Linki

Molecular Biology Blog Biologii Molekularnej Blog

Send this page to a friend Wyślij tę stronę znajomemu

Intracellular Stations Stacje wewnątrzkomórkowa

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Przeciwciało Botanika Wspólnej Zderzaki Zderzaki Alfabetyczna Księgarnia Biologii Komórki i Kultury elektroforeza Histologii Microarrays Immunologia Spektrometrii Mas Mikrobiologii obrazowanie molekularne Peptide Proteomika Protein Microarray Chips PCR, Real-Time PCR RNAi i SiRNA Stem Cell Biology Transfekcja Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protokoły

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkty

Western Blot Books Western Blot Książki

Western Blot Troubleshooting Western Blot Rozwiązywanie problemów

Western Blot Books Western Blot Książki

Western Blotting Protocol Western blotting Protokół

Western-blot protocol Western-blot protokół

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Przygotowanie próbek do SDS-PAGE elektroforeza Przygotowany z Komórka Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Przygotowanie żelu do SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Przygotowanie uruchomiony 1X buforu
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Dodaj 50 ml beta-merkaptoetanolu próbki do 950 ml buforu (1 ml). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (tylko jeśli nie pre-beta-merkaptoetanolu dodana do próbki bufor)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Dodaj do buforu próbki każdej próbki (wstępnie określić, ile próbki można załadować za dobrze - BioRad cienkich plastrów może utrzymać około 30uL. Grzebienie Duży może accomate do 50uL).
5. Vortex samples briefly. Vortex próbek krótko.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Poke dziury w Cap każdej rurki (aby zapobiec blaty trzaskający podczas wrzenia)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Gotować ogrzewania w bloku / na łaźni wodnej (95 ° C) przez 5 minut (niższych temperaturach zostały wykazane, aby zapobiec braku specyficznych białek agregacji)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel Po Boiling białka Próbki - Ładowanie i uruchamianie SDS-PAGE Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Wirować próbki do 1 minuty z dużą prędkością.
2. Load sample into each lane. Załaduj próbki do każdego pasa.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Załaduj MW (masie cząsteczkowej ladder) odniesienia. (you may want (może być
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Uruchom żel na 100V (100V poprzez stacking żel, napięcie może być zwiększony do 200V, kiedy uruchomiony w żel rozdzielający z dużą działa bufor)

Transfer of Protein Samples to Membrane Transfer białka Próbki do membran

1. Prepare 1X Transfer buffer Przygotowanie 1X buforu transferu
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Zanurzyć żel i wytrząsnąć bufor do transferu w 15 min
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Zanurzyć nitroceluloza membrana (lub PVDF) i bibuły filtracyjnej (extra grubości) przez kilka minut.
4. Place sandwich on transfer cell: Miejsce Sandwich na przeniesienie komórki:

Extra thick filter paper CLEAR Dodatkowe grubą bibułę CLEAR
Membrane Membrana
Gel
Extra thick filter paper BLACK Dodatkowe grubą bibułę BLACK

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Electric transferu: 90V lub 35V overnite do 1 godziny w zależności od rozmiaru białka lub cierpliwość!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western blotting protokołu lub immunologicznego

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Przygotowanie 1X TBST z roztworów.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Przygotowanie blokowania bufor (3% Albumina surowicy wołowej lub 5% blotting klasy mleka (Blotto) w TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (być może warto spróbować kilka razy i blokowanie różnych warunkach).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Umyć membrana 1X w TBST z wstrząsając przez 10 min.
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Blok w temperaturze pokojowej do 1 godziny z blokowaniem bufor (wytrząsanie lub okrągłym rotacyjny)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Inkubować swoje membrany (PVDF lub nitrocelulozy) z podstawowej 1 ° Ab przeciwciało overnight (blotting trudnych warunkach czyli fosforylacja białek) lub do 1 godziny (proste warunki, takie jak białka ogółem) w temperaturze 4 ° C (overnite) lub w temperaturze pokojowej (1 godzinę inkubacji tylko) pokryte Saran wrap (delikatnie wytrząsając). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Można skorzystać z wanny z tworzyw sztucznych dolara do tego sklepu (tylko do korzystania z tych blotting!) Lub użyć pipety polu u dołu. The dilution for primary antibody is around 1:1000. W rozcieńczeniu przeciwciał pierwotnych wynosi około 1:1000. See manufacturer's instructions. Patrz instrukcje producenta.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Umyć z 1X TBST 3 x 15 min
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Inkubować swoje membrany (PVDF lub nitrocelulozy) z przeciwciało wtórne, 2 ° Ab dla 30 - lub 45 minut (1 godzina - dla trudnych warunków blotting) w temperaturze pokojowej. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Do rozcieńczania wtórnego przeciwciał jest zazwyczaj wyższa lub 1:10000. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (tj. 1uL wtórnych w 10ml z membraną na TBST) Zobacz instrukcjami producenta. Może chcesz dodać swoje przeciwciała do blokowania rozwiązanie w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego zwłaszcza jeśli masz wysokie tło w swój pierwszy eksperyment.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Umyć z TBST 4-5 x 10 min. This is the most important washing step. Jest to najważniejszy krok do mycia.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Expose do filmu. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. Zwykle czas ekspozycji zachodniej blots wynosi około 10-30 sekund. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Dłuższe (5-10 minut) fosforylacja. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Jeśli masz bardzo słaby sygnał, albo musisz załadować więcej białka lub spróbować zwiększyć czas ekspozycji (do 30 minut - można spróbować pozostawiając go w kasecie dłużej).
11. Keep your membrane! Keep your membrana! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Możesz zachować swoje membrany w TBST 1X w lodówkę za chwilę. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). Być może trzeba ją z następujących powodów: 1) kontrola ładowania (papier oddający opinię może zwrócić się do białka całkowitego lub załadunku standardowych, takich jak aktyny). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. Ponadto, można sondy początkowo na białko-fosforan a następnie taśmy i reprobe dla białka ogółem.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol Zobacz również nasz Western blotting Membrana Stripping Protokół