home > protein-microarrays > protein-chip-detection > index.php Strona główna> białka microarrays> białko-chip-wykrywania> index.php
 |
|---|
 |  |  |  |  |  |
|---|---|---|---|---|---|
Protein Array Protocols Array Protein Protocols | Protein Array Bioinformatics Protein Array Bioinformatyka | Learn about Protein Arrays Dowiedz się więcej na temat Protein Arrays | Protein Array Kits and Products Protein Array Zestawy i produkty | Protein Array Forum Protein Array Forum | Proteomic News Proteomic Aktualności |
Protein and Antibody Microarrays Protein Microarrays i Antibody
Detection Methods and Non-specific Binding Metody wykrywania i wiązania niespecyficznego
Non-specific binding to the array needs to be minimized and this is typically done by immersing the arrays in a bovine serum albumin based buffer (BSA) (31). Wiązanie niespecyficzne do tablicy musi być zminimalizowany i jest to zwykle wykonywane przez zanurzenie w tablice w albuminy surowicy bydlęcej based buffer (BSA) (31).
Analyte-binding and retention on protein arrays proceeds via thermodynamically driven binding mechanism similar to the hybridization of nucleic acid targets to probes. However, the detection of bound targets to proteins is considerably more complex than that of DNA microarray detection (9). Currently a variety of detection methods are being examined. For example, ELISA was first used to detect proteins for both filter arrays (66,67) and glass arrays (68). Analit wiążące i zatrzymywania na białko tablice wpływów za pośrednictwem thermodynamically napędzane wiąże mechanizm podobny do hybrydyzacji kwasów nukleinowych do celów sondy. Jednakże, wykrywania cele związane z białkami jest znacznie bardziej skomplikowane niż w przypadku wykrycia Mikromacierz (9). Obecnie różne metody wykrywania są badane. Na przykład, po raz pierwszy została zastosowana ELISA do wykrywania białka dla obu filtrów tablic (66,67) oraz tablic ze szkła (68). ELISA based detection methods have the disadvantage of non-specificity of protein-antibody interactions, leading to many false positives. Radioisotope labeling was used by Ge et al. (22), radioisotope labeling to study protein–protein, protein–DNA, protein–drug interactions on filter arrays. Zhu et al. used radioisotope labeling to conduct kinase assays of different substrates by using purified yeast kinase proteins on a array (36). The preferred method of detection is fluorescence detection because these methods are generally safe, extremely sensitive, simple and can have very high resolution. These detection methods are also compatible with standard microarray scanners. ELISA oparty metody wykrywania mieć ujemny wpływ braku szczególnego charakteru interakcji białko-przeciwciało, co prowadzi do wielu fałszywych alarmów. Radioisotope Oznaczanie był używany przez GE et al. (22), radioisotope do badań Oznaczanie białka białko, białko-DNA, białka Interakcje lekowe na filtr tablic. Zhu et al. radioisotope Oznaczanie wykorzystywane do prowadzenia analiz kinazy różnych podłożach przy użyciu oczyszczonych drożdży kinazy białek na tablicy (36). preferowaną metodą wykrywania fluorescencji wykrywania, ponieważ metody te są ogólnie bezpieczne, bardzo wrażliwy , Proste i może mieć bardzo wysokiej rozdzielczości. Metody wykrywania są również kompatybilne ze standardową microarray skanery. Generally, a chip is either directly probed with a fluorescent molecule (eg a fluorescently labeled protein or small molecule, by using a tagged probe (eg biotin), which can then be detected in a second step using a fluorescently labeled affinity reagent (eg streptavidin) (16,56). Another fluorescent labeling method is rolling circle amplification (RCA), which is also extremely sensitive (32). Ogólnie rzecz biorąc, chip jest albo bezpośrednio z probed fluorescencyjny cząsteczki (np. fluorescencyjne, oznaczone lub małe cząsteczki białka, przy użyciu sondy oznaczone (np. biotyna), które następnie mogą zostać wykryte w drugim kroku za pomocą fluorescencyjne oznaczone powinowactwo odczynnika (np. Streptawidyna ) (16,56). Inną metodą jest fluorescencyjny Oznaczanie toczenia koła amplifikacji (RCA), który jest także bardzo wrażliwa (32).
Although the proteomes under comparison can be labeled in a comparable fashion with fluorophores, the reproducibility of these chemical reactions is poor and interference with the protein-antibody interactions presents an additional complexity (9). Chociaż proteomes podstawie porównania mogą być oznaczone w sposób porównywalny z fluorophores, odtwarzalności tych reakcji chemicznej jest słabe i ingerencji w interakcje białko-przeciwciało przedstawia złożoność dodatkowe (9). Also, non-uniform labeling of proteins can be addressed by performing a dual-colour ratiometric assay, where an internal standard is present for each target protein which is measured (9). Ponadto, niejednolite Oznaczanie białek może być skierowana przez wykonywanie podwójnego kolor ratiometryczne teście, gdzie jest wzorzec wewnętrzny przedstawia dla każdego docelowego białka, które jest mierzone (9). A disadvantage of labeling proteins with fluorophores is a reduction of the quantitative accuracy of the assay, as incorporation of the label may alter the binding properties of the proteins (9). A niekorzyść Oznaczanie białek z fluorophores jest zmniejszenie dokładności ilościowej analizy, jak włączenie etykiecie mogą zmienić właściwości wiążące białka (9).
Although direct protein labeling detection methods are still widely used, the intrinsic problems mentioned has resulted in the increasing use of label free detection methods for protein microarrays. These methods are mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (AFM) (70), and surface plasmon resonance (SPR) (71). Chociaż bezpośrednie metody wykrywania białka etykietowania nadal są szeroko stosowane, istotnych problemów wymienionych przedstawiała się następująco rosnące wykorzystanie etykiety wolnego metody wykrywania białka microarrays. Metody te są spektrometria masowa (MS), mikroskopia sił atomowych (AFM) (70), oraz Powierzchnia rezonansu plazmonowego (SPR) (71).
Non-labeling methods have advantages as a direct detection approach for antibody microarrays since labeling molecules affects protein activity. Non-labeling metody mają zalety jako bezpośrednie podejście do wykrywania przeciwciał microarrays, ponieważ wpływa na cząsteczki białka Oznaczanie aktywności. SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) mass spectrometry has been used to detect low-density arrays of captured proteins (69). SELDI (powierzchni wzmocnionej laserowe desorpcja / jonizacja) spektrometria masowa zostały użyte w celu wykrycia niskiej gęstości tablic schwytanych białek (69). Proteins are captured on a metal surface array (SELDI protein array) and are vapourized using a laser beam. Analysis using mass spectrometry data is then performed in order to reveal the identities of these proteins. Białka są uchwycone na metalowej tablicy (SELDI białka tablicy) i są vapourized za pomocą wiązki laserowej. Analiza danych za pomocą spektrometrii masowej jest przeprowadzane w celu ujawnienia tożsamości tych białek.
Atomic force microscopy (AFM) method uses surface topological changes to identify the captured proteins on an antibody array (70). Mikroskopu sił atomowych (AFM) metoda wykorzystuje powierzchni topologiczne zmian do identyfikacji białek złapany na tablicy przeciwciało (70). When rabbit IgG is immobilized on a gold surface and binds to its complimentary antibodies, goat ant-rabbit IgG, AFM detects the increase in height, and thus is able to measure binding interactions. However in order to study the kinetics of antigen–antibody interactions, real-time detection methods will be useful. Kiedy królik IgG jest unieruchomiony na powierzchni złota i wiąże się z jego complimentary przeciwciał, kóz ant-królik IgG, AFM wykrywa wzrost w wysokości, a więc jest możliwość interakcji środka wiążącego. Jednakże w celu badania kinetyki antygen-przeciwciało interakcji , W czasie rzeczywistym metod wykrywania będą przydatne. Surface plasmon resonance (SPR) has matured into a versatile detection tool to study the kinetics of receptor–ligand interactions with a wide range of molecular weights, affinities and binding rates (72-74). Powierzchnia rezonansu plazmonowego (SPR) dojrzewa do wykrywania wszechstronne narzędzie do badania kinetyki receptor-ligand interakcji z szerokiej gamy masy cząsteczkowe, powiązane i wiążące stawki (72-74). Commercial SPR chips are available however their detection resolution is limited. A sensor surface with 64 individual immobilization sites in a single flow cell was developed (75). An antibody array biosensor was also developed to study the kinetics of antigen binding using a planar waveguide as the detection method. Commercial SPR chipy są jednak ich wykrywania rozdzielczości jest ograniczona. Powierzchni czujnika z 64 unieruchomienia poszczególnych witryn w jednym przepływu komórek została opracowana (75). Przeciwciało tablicy biosensor został również stworzony, aby badanie kinetyki antygenu wiążące przy użyciu płasko Falowód jako metody wykrywania. Using this method, the group demonstrated that significant signal intensity could be achieved from spots as small as 200 mm in diameter. Korzystając z tej metody, grupa wykazała, że istotny sygnał intensywności mogłyby zostać osiągnięte z plamami tak małe, jak 200 mm średnicy. It is therefore expected that this approach will be suitable for high-throughput and parallel kinetics studies. Jest zatem oczekiwać, że takie podejście będzie odpowiednie dla wysokiej przepustowości i równoległe badania kinetyki. (76).
Range of Detection Zakres detekcji
Another difference between protein and DNA microarrays is that protein concentrations in a single biological sample or cells are several orders of magnitute greater than that for mRNAs. Thus protein chip detector systems must have a very large range of detection operation – up to a factor of 1014, compared to 104 for mRNA. Thus an antibody with nanomolar affinity to a particular target will be saturated by the presence of this target at micromolar concentrations and will fail to detect pico- or femtomolar target levels. Thus accommodating rare and abundant proteins will probably require separate arrays (7,8,9). Kolejną różnicą między białka i DNA microarrays to, że stężenia białka w jednej próbki biologiczne lub komórki są kilka rzędów magnitute większe niż dla mRNAs. Zatem białka chipa detektora systemów muszą mieć bardzo duży zakres operacji wykrywania - do czynnika 1014 , W porównaniu do 104 na mRNA. Tak przeciwciało z nanomolar powinowactwo do konkretnego docelowego będzie nasycony przez obecność na ten cel micromolar koncentracji i nie do wykrycia Pico-femtomolar lub poziomów docelowych. Przychylne Tak rzadkie i obfite białka będą prawdopodobnie wymagać oddzielnych tablic (7,8,9).
Multiple antibodies with varying affinities for the target may be positioned at different areas of the array however studies have shown that only 20% of arrayed antibodies provide measurements of proteins at low concentrations (33). Wiele z różnym powiązane przeciwciał dla docelowego mogą być rozmieszczone na różnych obszarach tablicy jednak badania wykazały, że tylko 20% ustawił dostarczyć pomiarów przeciwciał białek w niskich stężeniach (33).
Next: Protein Production for Protein Arrays Dalej: białka do produkcji Protein Arrays
References for Protein and Antibody Microarrays Odniesienia do białka i przeciwciał Microarrays
Back to: Powrót do:
Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. Wprowadzenie i kontekst białka i przeciwciał Chips Chips.
Types of Antibody and Protein Chips Rodzaje przeciwciała i białka Chips
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Zastrzeżenie / Terms of Service | Privacy Policy | © 2005-2007 Molekularnej Station.com, Wszelkie prawa zastrzeżone.
Send this page to a friend Wyślij tę stronę znajomemu
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
