Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

PCR Protocols PCR Protocols	PCR Bioinformatics and Databases PCR bioinformatyki i bazy danych	Learn about PCR Dowiedz się więcej na temat PCR	PCR Kits and Products Zestawy i produkty PCR	PCR Forum PCR Forum	PCR Books PCR Książki

Successful PCR Conditions Udane Warunki PCR

Parameters for Successful PCR Parametry dla pomyślnego PCR

Are you having problems of achieving a successful PCR?  Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.  Also Thermal Cycling Considerations:  PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. Czy masz problemy z osiągnięcia sukcesu PCR? Wiele czynników może wpłynąć na wyniki Twojej PCR, takich jak: Metal Ion Cofactors, Podłoże Podłoże i analogi, soli i buforów i Cosolvents. Thermal Również Kolarstwo Uwagi: PCR Statki, temperatury i czasu optymalizacji, PCR Amplification Cycles, Enzym / target i Hot Start.

Metal Ion Cofactors and PCR Metal Ion Cofactors i PCR

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.  Its concentration must be optimized for every primer:template system. Istotnym cofactor dla polimerazy DNA w PCR jest Chlorek magnezu. Jego stężenie musi zostać zoptymalizowany dla każdego primera: szablon. Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. Wiele składników reakcji wiązania jonów magnezu, włączając w to środki gruntujące, szablon, produktów PCR i dNTPs. The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. Głównym 1:1 wiążący dla jonów magnezu jest wysokie stężenie dNTPs w reakcji. Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. Ponieważ jest to niezbędne dla swobodnego jonów magnezu służyć jako enzymu cofactor w PCR, całkowite stężenie jonów magnezu musi przekraczać całkowitego stężenia dNTP. Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. Zazwyczaj, aby rozpocząć proces optymalizacji, 1,5 mM chlorku magnezu jest dodawany do PCR, w obecności 0,8 mm Całkowita dNTPs. This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. Pozostawia to około 0,7 mM wolne magnezu dla polimerazy DNA. In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. W ogóle, jonów magnezu powinny być zróżnicowane w koncentracji z serii 1.5-4.0 mm, 0,5 mM kroki.

Substrates and Substrate Analogs for PCR Podłoże i analogi substratów do PCR

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.  They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. Polimeraz DNA zawierają bardzo skutecznie dNTPs. Oni również mogą zawierać zmodyfikowano substratów, gdy są one używane jako dodatkowe komponenty w PCR. Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. Przykłady substratów używanych do polimerazy DNA są: Digoxigenin-dUTP, biotyna-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, fluorescencyjne i oznaczone dNTPs. For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. W konwencjonalnych PCR, stężenie dNTPs pozostaje w equimolar wyważone proporcje, np. 200 μ m każdego dNTP. Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. Należy również pamiętać, że odchylenia od tych standardowych zaleceń może być korzystna w pewnych amplications. For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. Na przykład, kiedy losowo mutagenności z konkretnym celem jest pożądane, asymetryczne dNTP promowania koncentracji wyższego stopnia misincorporations przez polimerazy DNA.

Buffers and Salts for PCR Bufory i sole do PCR

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. W zależności od polimerazy DNA wykorzystywane do PCR bufor optymalne stężenie, stężenie soli, a pH powinno być zbierane odpowiednio do polimerazy DNA. The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. PCR bufor do Taq polimeraza DNA składa się z 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, w temperaturze pokojowej. This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. Bufor ten zapewnia jonowych wytrzymałość i zdolność buforowania potrzebne w trakcie reakcji. It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. Ważne jest, aby pamiętać, że stężenie soli wpływa na Tm na primer: szablon dupleksu, a co za tym idzie temperatura wyżarzania.

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. Różne PCR Cosolvents są wykorzystywane do zwiększenia wydajności, skuteczności i specyficzność PCR amplifications. These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. Te cosolvents może być korzystna w pewnych amplifications, i niekorzystne w innych amplifications. It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. Jest to niemożliwe do przewidzenia, który będzie użyteczny dodatek dla każdego primera: szablon duplex cosolvent i dlatego muszą być testowane empirycznie dla każdej kombinacji.

Thermal Cycling Considerations Thermal Kolarstwo Rozważania

PCR Vessels Statki PCR

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. PCR muszą być wykonywane w statki, które są zgodne z niskiej ilości enzymów i kwasów nukleinowych i które mają dobre właściwości termiczne transferu. Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. Zwykle, polipropylen jest wykorzystywane do PCR statków i konwencjonalnych, grubościennych rur mikrowirówce są wybierani Termocykler dla wielu systemów. PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. PCR jest najczęściej wykonywane w reakcji 10-100 μ l skalę i wymaga przeciwdziałania parowania / kondensacji procesów w zamkniętej probówce reakcja termicznego podczas jazdy na rowerze. A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. A olej mineralny lub woskowa warstwa nakładki służy temu celowi. More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. Niedawno, 0,2 ml cienkościennych statki zostały zoptymalizowane dla procesu PCR i olej wolne cyclers termicznego zostały zaprojektowane, aby korzystać z podgrzewaną okładka na rury, która odbyła się w ramach próby bloku.

Temperature and Cycle Time Optimization Temperatura i Optymalizacja czasu cyklu

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. Istotne jest, aby dotrzeć do mieszaniny reakcyjnej denaturacji, wyżarzanie, rozszerzenie i temperatury w każdym cyklu termicznego. If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. Jeśli posiadają niewystarczające czas określony jest w każdej temperaturze, temperatura próbki nie będą equilibrated się z próby bloku. Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. Niektóre Termocykler wzorów ładowni odstępie czasu w oparciu o blok temperatury, podczas gdy inne podstawy do posiadania na czas przewidywany temperatury próbki. If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. Jeśli konwencjonalnych grubościennych rurki używane w cycler kontrolowane przez blok temperatury, 60-y posiadają czas jest wystarczający dla równoważenia. Extra time may be recommended at the (72°C) extension step for longer PCR products. Dodatkowy czas może być zalecana u (72 ° C) rozszerzenie już krok do produktów PCR. Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. Korzystanie z cienkościennych 0,2 ml probówki w cycler kontrolowane przez przewidywane temperatury próbki, tylko 15 s jest wymagane. To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. Aby korzystać z istniejących protokołów lub protokołów rozwoju do użytku w wielu laboratoriach, bardzo ważne jest, aby wybrać posiadają razy zgodnie z cycler projektowania i grubość ścianek rurki.

PCR Amplification Cycle Number Cykl Liczba PCR Amplification

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. Ilość cykli amplifikacji PCR powinny być zoptymalizowane w stosunku do początkowej koncentracji docelowego DNA. It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. Zaleca się, że od 40 - 45 cykli do nagłaśniania 50 cząsteczek docelowych, 25-30 cykli do nagłaśniania 3 × 105 cząsteczek na tej samej koncentracji. This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. To nie proporcjonalności jest spowodowany przez tzw efekt plateau, w których gwałtowny spadek stopy akumulacji produktu odbywa się w późnych stadiach o PCR. This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. To może być spowodowane przez degradacji Reagenty (dNTPs, enzym); reactant wyczerpywanie (pierwsze, dNTPs); końcowego produktu hamowania (pirofosforan formacji); konkurencji dla Reagenty przez nie konkretnych produktów lub konkurs na primer wiążące przez reannealing koncentratu ( 10 nm) produktu. It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. Jest to zazwyczaj zaleca się uruchomić minimalna liczba cykli potrzebna, aby zobaczyć żądany produkt szczególny, ponieważ nonspecific niechciane produkty będą przeszkadzać, jeżeli liczba cykli jest nadmierny.

Enzyme / Target Enzym / Target

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. W standardowym podwielokrotności Taq polimeraza DNA wykorzystywane do 100 - μ l reakcji, istnieje około 1010 molekuł. Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. Każdy PCR próbki powinny być oceniane w odniesieniu do liczby docelowej kopii zawiera lub może zawierać. For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. Na przykład, od 1 lambda DNA zawiera 1,8 × 107 egzemplarzy. For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. W przypadku niskich dawek skopiować numer PCR, enzymu staje się ograniczenie i może być konieczne do przedłużenia procesu stopniowo więcej czasu. Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. Thermal cyclers może niezawodnie wykonywać tego segmentu automatyczne przedłużenie procedury w celu maksymalizacji PCR plon.

Hot Start Conditions Hot Start Warunki

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. Wszystkie powyższe optymalizacje również zastosowanie do PCR, które są zaprojektowane od początku, gorący start metoda. Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. Często zdarza się, że gorący początek może być skutecznie włączona do wcześniej zoptymalizowany PCR bez zmiany warunków reakcji. However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. Niemniej jednak, zwykle płaci się po reoptimize dodając gorący start. Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. Optymalizacja jest często równowagi między producentami, jak wiele produktów, jak to możliwe i overproducing nonspecific, tła amplifications. Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. Ponieważ gorący start tle znacznie zmniejsza amplifications, górne ograniczenia są podniesione w sprawie warunków, takich jak stężenie enzymu, numer cyklu, a cofactor stężenia jonów metali. Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. Drażliwe PCRs, które zostały dostrojone bez bardzo gorący początek może zawieść, gdy jest gorący początek dodaje. This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. To może być spowodowane przez nieznaczne opóźnienia w pierwszych cyklach spowodowanych przez mieszanie lub aktywacji enzymu. The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. PCR zazwyczaj może być przywrócony, często ze znacznego wzrostu konkretnego produktu, po prostu przez zwiększenie lub ograniczenie parametrów odczynników. In addition, there are optimizations specific to each hot start method. Ponadto, optymalizacje są specyficzne dla każdego startu ciepłego metody. Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. Mieszanie lub aktywacji enzymu może mieć wpływ na wielkość PCR, bufor pH i składu, cosolvents, warunki jazdy na rowerze, i tak dalej. The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. Do konkretnego produktu, literatury, często produkcie, należy zasięgać informacji na temat tych zagadnień.