Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

DNA Protocols DNA Protokoły

DNA Encyclopedia Encyklopedia DNA

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatyka

DNA Forum Forum DNA

DNA Blog DNA blog

DNA News DNA Aktualności

DNA Books DNA Książki

DNA Footprinting DNA Footprinting

Copyright 2007 Molecular Station Copyright 2007 Molekularnej Station

Background on DNA Footprinting Dodatkowe informacje na temat DNA Footprinting

DNase footprinting is a molecular biology method that enables the detection of DNA-protein interactions by exploiting the property that a protein interacting with DNA will protect the DNA at that interaction site from restriction digestion or DNAase enzymatic cleavage. DNase footprinting jest biologia molekularna, że metoda pozwala na wykrycie DNA-białko interakcji poprzez wykorzystanie własności, że białka interakcji z DNA będzie chronić DNA w tym miejscu interakcji z ograniczenia trawienia lub enzymatycznej DNAase łupliwości. A DNA restriction fragment which contains the specific binding site is labeled at one end, usually with 32P and used for footprinting. Ograniczenie fragment DNA, który zawiera konkretne witryny wiąże się z etykietą na jednym końcu, zwykle z 32p i wykorzystywane do footprinting.

Protein and DNA are allowed to hybridize and bind together. Białka i DNA, dopuszcza się krzyżowały i wiążącym razem.

DNA footprinting utilizes the enzyme DNase I or d eoxyribo n ucleic acid nucle ase I in order to digest or cut away free radiolabeled (or labelled) DNA leaving the protein bound DNA protected. DNA footprinting wykorzystuje enzymu DNase I lub d eoxyribo n ucleic kwasu nucle ase I w celu zestawienia lub wyciąć wolne od radiolabeled (lub oznakowane), pozostawiając DNA białka wiążące DNA chronione. The DNA restriction fragments are treated lightly with DNase I, which makes single-strand breaks (nicks) in the DNA. Ograniczenie fragmenty DNA są traktowane lekko z DNase I, co sprawia, że single-strand breaks (Nicks) w DNA. A small amount of enzyme is used such that there is an average of less than 1 nick/strand. Niewielka ilość enzymu jest wykorzystywane w taki sposób, że jest średnio mniej niż 1 nick / aspekt. The reaction is then stopped, the DNA is denatured, and the mixture is run on a denaturing polyacrylamide sequencing gel. Reakcja jest zatrzymana, DNA jest skażone, a mieszanina jest uruchamiany na denaturacji sekwencjonowanie żelu poliakrylamidowym. These fragments separated by gel electrophoresis are exposed to detect the protected DNA area by analyzing the banding cleavage pattern on the gel. Te fragmenty oddzielone elektroforeza są narażone na wykrycie DNA obszaru chronionego przez analizowania wąskich cleavage wzór na żel.

The cleavage pattern of the DNA in the absence of a DNA binding protein, typically referred to as free DNA, is compared to the cleavage pattern of DNA in the presence of a DNA binding protein. W cleavage strukturze DNA w przypadku braku białka wiążące DNA, zazwyczaj określane jako wolne DNA, w porównaniu do łupliwości struktury DNA w obecności białka wiążące DNA. If the protein binds DNA, the binding site is protected from enzymatic cleavage. Jeżeli wiąże się z białkami DNA, wiąże witryny jest chroniony przed enzymatycznym łupliwości. This protection will result in a clear area on the gel which is referred to as the "footprint". Ochrona ta spowoduje wyraźne strefy na żel, który jest określany jako "ślad".

By varying the concentration of the DNA-binding protein, the binding affinity of the protein can be estimated according to the minimum concentration of protein at which a footprint is observed. Zmieniając stężenie DNA-białko wiążące, wiążące powinowactwo do białka może być oszacowane według minimalne stężenie białka w których ślad jest przestrzegane.

DNAse Footprinting Buffer Recipes DNAse Footprinting buforowych Recipes

DNase Footprinting Binding Buffer Recipe DNase Footprinting Wiążąca buforowych Recepta

2X w/o KCl / For 10mls: 2X w / o KCl / Dla 10mls:

amount: [final] wysokość: [wersja ostateczna]
Tris-HCl pH7.6: 500 ul of 1M: 50 mM Tris-HCl pH7.6: 500 z ul 1M: 50 mm
MgCl2: 125ul of 1M: 12.5mM MgCl2: 125ul z 1M: 12.5mM
EDTA: 2 ul of 0.5M: 1mM EDTA: 2 z ul 0.5M: 1mm
Glycerol: 2 mls: 20% Gliceryna: 2 mls: 20%
DTT : 10 ul of 1M: 1 mM DTT: 10 z ul 1M: 1 mm

Binding Buffer (Gel Shift buffer) Wiążąca Buffer (bufor Gel Shift)

5X w/o KCL 5X w / o KCl
[final]: ingredient [wersja ostateczna] składnika
20%: gylerol 20%: gylerol
5mM: MgCl2 5mm: MgCl2
2.5mM: EDTA 2.5mM: EDTA
2.5mM: DTT 2.5mM: DTT
250mM: NaCl 250mM: NaCl
50mM: Tris-HCL, pH 7.5 50mm: Tris-HCl, pH 7,5
0.25mg/ml: poly (dI-dC) poly (dI-dC) 0.25mg/ml: poli (DI-DC) poli (DI-DC)

Ca/Mg Buffer Ca / Mg buforowych

For 10mls Dla 10mls
CaCl2: 50 ul of 1M: 5 mM CaCl2: 50 z ul 1M: 5 mm
MgCl2: 100 ul of 1M: 10 mM MgCl2: 100 z ul 1M: 10 mm

Loading Solution Ładowanie Solution
0.1 M: NaOH:formamid (1:2 v/v) 0,1 M: NaOH: formamid (1:2 v / v)
0.1%: xylene cyanol 0,1%: ksylen cyanol
0.1%: bromophenol blue 0,1%: błękitu bromofenolowego

Stop Buffer Stop buforowych
10mls
NaCl: 400 ul of 5M: 200 mM NaCl: 400 z ul 5M: 200 mm
EDTA: 600 ul of 0.5M: 30 mM EDTA: 600 z ul 0.5M: 30 mm
SDS: 1 ml 10%: 1% SDS: 1 ml 10%: 1%

TEBe (Tris-EDTA-Beta mercap.) Tebe (Tris-EDTA-Beta mercap.)
Tris-HCl, pH 7.6: 500 ul of 1 M: 50 mM Tris-HCl, pH 7,6: 500 ul dnia 1 M: 50 mm
EDTA: 2ul of 0.5 M: 1 mM EDTA: 2ul do 0,5 m: 1 mm
Beta-mercaptoethanol: 10 ul : 15mM Beta-merkaptoetanolu: 10 ul: 15mm

10 x K buffer 10 x bufor K
for 1 ml do 1 ml
Tris-HCl pH 7.5: 100 ul of 1 M: 100 mM Tris-HCl, pH 7,5: 100 ul 1 m: 100 mm
MgCl2: 100 ul of 1 M: 100mM MgCl2: 100 ul 1 m: 100mm
DTT: 50 ul of 1M: 50 mM DTT: 50 z ul 1M: 50 mm
dH2O: 750 ul dH2O: 750 ul

DNAse Footprinting Protocol Protokół DNAse Footprinting

The DNA used usually contains the binding site of your protein of interest. DNA stosowane zwykle zawiera wiążące białka Twojej stronie interesów. The DNA is purified, then digested with restriction fragments to be of an appopriate size. DNA jest oczyszczana, a następnie wytrawia z fragmentów, które mają być ograniczenia w stosownych rozmiarów. The DNA fragment is labeled on one end (binding site > 25 bp from end). W fragment DNA jest oznaczone na jednym końcu (wiążące witryny> 25 pb od końca).

One strand labeling can be accomplised by: Jeden aspekt etykietowania można accomplised przez:

1. isolating the fragment with restriction enzyme(s) containing 5' overhang, labeling with Klenow and the appropriate hot nucleotide. izolowanie fragment z ograniczeniem enzym (y) zawierające 5 'przedni, etykietowania z Klenow i odpowiednie gorąco nukleotydów. Then digest with an enzyme that removes one end. Następnie zestawienie z enzymu, który usuwa jeden koniec.
2. isolating a fragment digested with a restriction enzyme that creates 5' and 3' end, labeling with Klenow will only label the 5' overhang. izolowanie fragment wytrawić z ograniczeniem enzymu, który tworzy 5 'i 3' końcu, etykietowania z Klenow tylko etykiety 5 'przedni.
3. As in "a" but with any enzyme and using polynucleotide kinase to label 3' end (kinase) and digesting off one of the ends with a second (third) restriction enzyme. Podobnie jak w "a", ale z każdą i za pomocą enzymu kinazy polinukleotydowe etykiety do 3 'końca (kinazy) i digesting od jednego z końców z drugiej (trzeciej) ograniczenie enzymu.
   (REMINDER: if labeling with Klenow, at the end of reaction add an excess of cold nucleotide of the same nucleotide that is labeled ( ie if you use dCTP32, add dCTP at the end) to make sure all ends are filled in equally. (UWAGA: jeśli etykiety z Klenow, na koniec dodać reakcji nadmiar zimnego nukleotydów tego samego nukleotydów, które są oznaczone (np. jeśli używasz dCTP32, dCTP dodać na końcu), aby upewnić się, wszystko kończy się w równym stopniu są wypełnione.

For Klenow fragments, 0.3ug bring up to 100 ul in TE, heat kill Klenow at 68 °C for 10 minutes. Dla Klenow fragmenty, 0.3ug wprowadzają do 100 w ul TE, ciepła zabić Klenow na 68 ° C przez 10 minut.

LABELING with one 5' overhang Oznaczanie z 5 'przedni

Sample RXN : 15 ng is need for each reaction. Przykładowe RXN: od 15 dla każdego jest konieczność reakcji. If making probe for many reactions JUST increase amount of DNA up to 300 ngs. Jeśli sondy do podejmowania wielu reakcji JUST zwiększenie ilości DNA do 300 NGS.
15ng: DNA fragment 15ng: fragment DNA
2 ul: 10x K buffer 2 ul: 10x bufor K
5 ul: 32P dCTP 3.33 uM 10 uCi/ul 5 ul: 32p dCTP 3,33 um 10 UCI / ul
2 ul: 2mM @ dA, dG dTTP 2 ul: 2mm @ dA, DG dTTP
1 ul: Klenow 1 ul: Klenow
20 ul Final volume, 37°C 30 min. Ul końcowej objętości 20, 37 ° C 30 min.
--add 1 ul 10mM dNTP, 5 min @ 37°C . -- dodać 1 ul 10mm dNTP, 5 min @ 37 ° C.

--add 80 ul TE. -- dodać 80 TE ul. 68°C 15 minutes, put on ice. 68 ° C 15 minut, położony na lodzie.
--G-50 Spin Column (spin at about 2000g) -- G-50 Kolumna Spin (spin na około 2000g)
--ADD 1/10 vol 3M Na0Ac, 2.5 volumes EtOH, Ice 30 mins, (Optional if [DNA] is = or > 3 ng/ul you might post G-50 directly) Microfuge 30 minutes. -- ADD 1 / 10 obj 3M Na0Ac, 2,5 wielkości EtOH, Lód 30 min, (Opcjonalnie, jeśli [DNA] = lub> 3 ng / ul możesz po G-50 bezpośrednio) Microfuge 30 minut.
--wash with 70% -- zmywanie z 70%
--Dry Bring up in 5ul -- Suche wyprowadzić w 5ul

Binding Reaction For DNase Footprinting Wiążąca reakcja dla DNase Footprinting

Binding Reaction should have between 10 and 150mM KCl (more salt reduces binding but increases specificity). Wiążąca reakcji powinna mieć między 10 a 150mm KCl (więcej soli zmniejsza wiążące, ale zwiększa swoistość). The typical concentration is 50mM. Typowe stężenie wynosi 50mm.

Protein DNA Binding: Na wiążącą DNA białka:
25 ul of 2X Binding Buffer w/o KCl 25 z ul 2X Wiążąca buforowych w / o KCl
5ul of 3 ng/ul unilabeled DNA 5ul z dnia 3 ng / ul unilabeled DNA
X ul of KCl to equal 10-150 mM KCl X ul KCl do równego 10-150 mM KCl
dH20 to equal 50 ul minus volume for binding protien dH20 do równego 50 ul minus wielkość wiążące dla protien
1-3 Footprinting Units of DNA binding protein (or 10 to 160 ug of Crude nuclear extract) 1-3 Footprinting Jednostki białko wiążące DNA (lub od 10 do 160 ug ropy jądrowej wyciąg)

--mix gently, ice 10 minutes. -- delikatnie, lód 10 minut.

KEEP TIMING IN MIND, KEEP TERMINARZ na uwadze,
--ADD 50 ul of RT Ca/Mg solution, 18°C for 1 minute. -- ADD 50 z ul RT Ca / Mg roztwór, 18 ° C do 1 minuty.
--ADD 3 ul dilute RQ1 DNase (0.05 u/ul diluted in Tris) INCUBATE 1 minute. -- Dodać 3 ul rozcieńczyć RQ1 DNase (0,05 i / ul rozcieńczone w Tris) Inkubować 1 minuty.
--STOP addition of 90 with 37°C STOP solutions, -- STOP dodanie 90 z 37 ° C STOP rozwiązań,

--you should Phenol: CIA, and CIA extract, and Ethanol precipitate. -- należy Fenol: CIA, CIA i ekstraktu, alkoholu etylowego i osad.
--RESUSPEND in 4ul of Loading Solution. -- Zawiesić w 4ul załadunku Solution.
--Run on 5% standard Urea-DNA sequencing gel (consider wedge gel) with appopriate loading lanes such as DNA ladder, uncut DNA, and controls. -- Uruchom w dniu 5% standardowej Mocznik-sekwencjonowanie DNA żelu (żel uważają klina) z załadunkiem stosownych pasy, takie jak DNA, drabiny, uncut DNA i kontroli.

Analyze footprinting pattern. Analizuj footprinting wzoru.

Troubleshooting and Problems? Rozwiązywanie problemów i Problemy? See the DNAse Footprinting Forum! Zobacz DNAse Footprinting Forum!

For problems and troubleshooting DNAase footprinting, post a new thread to discuss it in the DNA Footprinting Forum ! W przypadku problemów i rozwiązywania problemów DNAase footprinting, po nowy wątek do dyskusji w DNA Footprinting Forum!

Other DNA Protocols and Methods Inne DNA Metody i protokoły

DNA Cloning Guide Klonowanie DNA Przewodnik

DNA Gel Electrophoresis DNA elektroforeza

Restriction Enzyme Digestion - all you need to know ! Ograniczenia Enzym Trawienie - wszystko co musisz wiedzieć!

Genomic DNA Isolation Protocol Izolacja genomowego DNA Protokół

Baceteria DNA Isolation Baceteria Izolacja DNA

DNA Transformation - Contains History of DNA Transformacja DNA - historia Zawiera DNA

Find other protocols at our DNA Protocols external resource directory or see our DNA protocols . Znajdź inne protokoły w naszym DNA protokołów zewnętrznych zasobów katalogu lub znaleźć w naszym DNA protokołów.

Related: Powiązane:

DNA Microarray Protocols Mikromacierz Protokoły

PCR Protocols PCR Protocols

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatyka

Visit DNA Bioinformatics . Odwiedź DNA bioinformatyki.

DNA-Related News DNA-Related News

DNA News DNA Aktualności