Welcome to Molecular Station! Zapraszamy do Molekularnej Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Musisz się zarejestrować zanim będziesz mógł umieścić na naszym forum lub skorzystać z zaawansowanych funkcji. Register Now! Zarejestruj się teraz! Its Free and Fast! Jego Darmowy i Fast!

Already registered? Już zarejestrowany? Login now below. Zaloguj się poniżej.

User Name: Nazwa użytkownika:

Password: Hasło:

Remember Me? Remember Me?

Already registered and Forgot your password? Już zarejestrowany i Zapomniałeś hasła? Click below to recover it. Kliknij poniżej, aby ją odzyskać.

Recover Lost Password Odzyskaj Nie pamiętam hasła

Join now - it's fast and free! Dołącz teraz - szybko i za darmo!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molekularnej Station to największa sieć badaczy, naukowców i miłośników nauki w dowolnym miejscu!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Zakładka Zakładka Site

Cell Transfection Komórka Transfekcja

This Transfection site is your portal for all things related to the transfection of cells with DNA plasmid or vector, RNA whether siRNA or RNAi, or even recombinant protein. Ta witryna jest Transfekcja portalu dla wszystkich rzeczy związanych z Transfekcja komórek DNA plazmidu lub wektor, czy RNA siRNA lub RNAi, lub nawet rekombinowanego białka. We provide you with all the background information, protocols for cell transfection, optimization and analysis steps, and cell transfection troubleshooting information to become the ultimate expert! Oferujemy Państwu wszystkie podstawowe informacje, protokoły Transfekcja komórek, analizy i optymalizacji działania oraz informacji na temat rozwiązywania problemów Transfekcja komórek stać się ostatecznym ekspertów!

Transfection Table of Contents Transfekcja Spis treści

• What is transfection? Transfekcja Co to jest?
• Background Tło
• Applications Wnioski
• Materials Materiały
• Transfection Methods Transfekcja Metody
• Buffers Zderzaki
  
• Preparation Przygotowanie
• Protocol Protokół
• Other T ransfection Protocols Inne T ransfection Protokoły
• Discussion Topics for Transfection Dyskusja na tematy Transfekcja
• Get Help on your Transfection Problems Pobierz Pomoc w Twoim Transfekcja Problemy
• Tips Porady
• Storing Przechowywanie
• Troubleshooting In Transfection Rozwiązywanie problemów W Transfekcja
• References Referencje

What is Transfection? Transfekcja Co to jest?

Transfection describes the introduction of foreign material into eukaryotic cells using a virus vector or other means of transfer. Transfekcja opisuje wprowadzenia obcych materiałów do komórek eukariotycznych przy użyciu wektora wirusa lub innych środków przenoszenia.

The term transfection for non-viral methods is most often used in reference to mammalian cells, while the term transformation is preferred to describe non-viral DNA transfer in bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae and plants. Termin Transfekcja for non-wirusowe metody jest najczęściej używane w odniesieniu do komórek ssaków, a pojęcie transformacji preferowany jest nie do opisania-wirusowego DNA bakterii w transferu i innych zwierząt, komórek eukariotycznych takich jak grzybów, glonów i roślin.

Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or 'holes' in the cell plasma membrane, to allow the uptake of material. Transfekcja komórek zwierzęcych zwykle pociąga za sobą otwarcie lub przemijające pory "dziur" w komórki plazmy membrany, w celu umożliwienia wykorzystania materiału. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Materiału genetycznego (np. supercoiled plazmidu DNA lub konstrukty siRNA), lub nawet białek, takich jak przeciwciała, mogą być transfected. In addition to electroporation, transfection can be carried out by mixing a cationic lipid with the material to produce liposomes, which fuse with the cell plasma membrane and deposit their cargo inside. Oprócz electroporation, Transfekcja mogą być przeprowadzane przez mieszanie lipidów kationowych jeden z materiałów do produkcji liposomów, które bezpiecznik z membraną komórki plazmy i złożenie ich ładunku wewnątrz.

The original meaning of transfection was 'infection by transformation', ie introduction of DNA (or RNA) from a eukaryote virus or bacteriophage into cells, resulting in an infection. Pierwotne znaczenie Transfekcja był zakażenia transformacji ", czyli wprowadzenie DNA (lub RNA) z Jądrowce wirusa lub bakteriofag do komórki, powodując zakażenie. Because the term transformation had another sense in animal cell biology (a genetic change allowing long-term propagation in culture, or acquisition of properties typical of cancer cells), the term transfection acquired, for animal cells, its present meaning of a change in cell properties caused by introduction of DNA. Ponieważ okres transformacji był w innym sensie zwierząt biologia komórki (zmiany genetyczne umożliwiające długoterminowe propagacji w kulturze, lub nabycie nieruchomości typowych komórek nowotworowych), termin Transfekcja nabytych, dla zwierząt, komórek, jego obecne znaczenie zmian w komórce nieruchomości spowodowanego przez wprowadzenie DNA.

Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Transfekcja jest metodą, za pomocą których eksperymentalne DNA mogą być dopuszczone do hodowli komórek ssaków. Such experiments are usually performed using cloned DNA containing coding sequences and control regions (promoters, etc) in order to test whether the DNA will be expressed. Takie eksperymenty są zwykle wykonywane przy użyciu imitacja kodowania sekwencji DNA, zawierających kontroli i regiony (promotorów, itp.) w celu sprawdzenia, czy DNA zostanie wyrażone. Since the cloned DNA may have been extensively modified (for example, protein binding sites on the promoter may have been altered or removed), transfection is often used to test whether a particular modification affects the function of a gene. Ponieważ sklonowane DNA może być w dużym stopniu zmodyfikowanych (na przykład, białka wiążące witryn na promotora może być zmienione lub usunięte), Transfekcja jest często używany do badania, czy dana zmiana dotyczy funkcji genu.

Transfection Diagram: Transfekcja wykres:

Transfection Applications Transfekcja Wnioski

The ability to synthesize RNA in the laboratory is critical to many techniques. Zdolność do syntezy RNA w laboratorium jest kluczem do wielu technik. Radiolabeled and non-radiolabeled RNA probes are required for many protocols, and they can be synthesized easily in small scale in vitro transcription reactions allowing their use in blot hybridizations and nuclease protection assays. Radiolabeled i non-radiolabeled sond RNA są wymagane dla wielu protokołów, i można je łatwo syntezy w małej skali in vitro transcription reakcje umożliwiające ich stosowanie w Hybrydyzacja hybridizations nukleazy ochrony i analiz.

Requirements for Transfection? Wymagania dotyczące Transfekcja?

• Vector or DNA Wektor DNA lub
• Cells Komórki
• Transfection Reagent Transfekcja Reagent

Optimizing Transfection Optymalizacja Transfekcja

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium Transkrypcja in vitro wymaga oczyszczone linearne DNA szablon zawierający promotor, ribonucleotide triphosphates, bufor systemu, który zawiera DTT i magnezu

Which Transfection Reagent to Use? Które Transfekcja odczynnika używać?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium Transkrypcja in vitro wymaga oczyszczone linearne DNA szablon zawierający promotor, ribonucleotide triphosphates, bufor systemu, który zawiera DTT i magnezu

Transfection Methods Transfekcja Metody

There are various methods of introducing foreign DNA into a eukaryotic cell. Istnieją różne metody wprowadzania obcego DNA do komórek eukariotycznych. Many materials have been used as carriers for transfection, which can be divided into three kinds: (cationic) polymers, liposomes and nanoparticles. Wiele materiałów zostały wykorzystane jako nośniki Transfekcja, które można podzielić na trzy rodzaje: (kationowe) polimery, liposomy i nanocząstek.

One of the cheapest (and least reliable) methods is transfection by calcium phosphate, originally discovered by FL Graham and AJ van der Eb in 1973[citation needed] (see also [1]). Jednym z najtańszych (i mniej wiarygodne) metod jest Transfekcja przez fosforanu wapnia, pierwotnie odkryty przez FL Graham i AJ van der Eb w 1973 roku [edytuj] (patrz też [1]). HEPES-buffered saline solution (HeBS) containing phosphate ions is combined with a calcium chloride solution containing the DNA to be transfected. HEPES buforowej roztwór soli (HeBS) fosforanów zawierających jony jest połączona z roztworu chlorku wapnia zawierające DNA, które mają być transfected. When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface. Kiedy dwa są połączone, grzywny osad z pozytywnie opłata wapnia i fosforanów negatywnie obciążony zostanie formularz, wiążące DNA transfected się na jej powierzchni. The suspension of the precipitate is then added to the cells to be transfected (usually a cell culture grown in a monolayer). Zawieszenie osad następnie dodaje się do komórki, które mają być transfected (zwykle komórki kultury wyhodowane na monolayer). By a process not entirely understood, the cells take up some of the precipitate, and with it, the DNA. Na proces nie w pełni zrozumiałe, komórki podjęcia niektórych osad, a wraz z nim, DNA.

Other methods use highly branched organic compounds, so-called dendrimers, to bind the DNA and get it into the cell. Inne metody wykorzystania bardzo rozgałęziony organicznych, tzw dendrimers, stało się ono wiążące DNA i otrzymać go w komórce. A very efficient method is the inclusion of the DNA to be transfected in liposomes, ie small, membrane-bounded bodies that are in some ways similar to the structure of a cell and can actually fuse with the cell membrane, releasing the DNA into the cell. Bardzo skutecznym środkiem jest włączenie się do DNA w transfected liposomów, czyli małe, membrana-ograniczone organów, które są w pewnym sensie podobna do struktury komórki i może faktycznie bezpiecznik z membrany komórek, uwalniając DNA w komórce . For eukaryotic cells, lipid-cation based transfection is more typically used, because the cells are more sensitive. Dla komórek eukariotycznych, lipidów-kacji oparte Transfekcja jest zwykle używany, ponieważ komórki są bardziej wrażliwe.

Another method is the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethylenimine. Inną metodą jest wykorzystanie kationowych polimerów, takich jak DEAE-zręczny lub polyethylenimine. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis. W negatywnie opłata wiąże się z DNA polycation i skomplikowane jest pobierany przez komórki za pośrednictwem Endocytoza.

A direct approach to transfection is the gene gun, where the DNA is coupled to a nanoparticle of an inert solid (commonly gold) which is then "shot" directly into the target cell's nucleus. Bezpośrednie podejście do Transfekcja genów jest karabin, gdzie DNA jest podłączony do nanoparticle na stałe obojętne (powszechnie złoto), która jest następnie "strzał" bezpośrednio w jądro komórki docelowej. DNA can also be introduced into cells using viruses as a carrier. DNA mogą być również wprowadzane do komórek przy użyciu wirusów jako przewoźnika. In such cases, the technique is called viral transduction, and, the cells are said to be transduced. W takich przypadkach, technika nazywa się wirusowe transdukcja, a komórki są uważane za transduced.

Other methods of transfection include nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection and proprietary transfection reagents such as Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene or DreamFect. Inne metody obejmują Transfekcja nucleofection, electroporation, szoku cieplnego, magnetofection i prawnie Transfekcja odczynników, takich jak Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene lub DreamFect.

Stable vs Transient Transfection Methods Stabilny vs Transient Transfekcja Metody

For most applications of transfection, it is sufficient if the transfected gene is only transiently expressed. Dla większości zastosowań Transfekcja, jest wystarczające, jeśli transfected gen jest tylko transiently wyrażone. Since the DNA introduced in the transfection process is usually not inserted into the nuclear genome, the foreign DNA is lost at the later stage when the cells undergo mitosis. Ponieważ DNA wprowadzone w Transfekcja proces jest zwykle nie dodaje się do genomu jądrowego, obcego DNA, jest stracił na późniejszym etapie, jeżeli komórki poddane Mitosis. If it is desired that the transfected gene actually remains in the genome of the cell and its daughter cells, a stable transfection must occur. Jeżeli jest to pożądane, że transfected gen rzeczywiście pozostaje w genom komórki i jej córka komórek, stabilne Transfekcja musi nastąpić.

To accomplish this, another gene is co-transfected, which gives the cell some selection advantage, such as resistance towards a certain toxin. Aby tego dokonać, innym gen jest współfinansowana transfected, która daje pewne komórki wyboru korzyści, takie jak odporność na rzecz niektórych toksyn. Some (very few) of the transfected cells will, by chance, have inserted the foreign genetic material into their genome. Niektórzy (bardzo niewiele) z transfected komórek będzie, szansa, dodaje obcego materiału genetycznego do ich genomu. If the toxin, towards which the co-transfected gene offers resistance, is then added to the cell culture, only those few cells with the foreign genes inserted into their genome will be able to proliferate, while other cells will die. Jeśli toksyn, wobec których współorganizatorem transfected oferuje genu odporności, następnie dodaje się do hodowli komórek, tylko tych kilka komórek z obcych genów dodaje się do ich genomu będą mogli rozmnażać się, podczas gdy inne komórki umrze. After applying this selection pressure for some time, only the cells with a stable transfection remain and can be cultivated further. Po zastosowaniu tej selekcji nacisku na jakiś czas, tylko z komórek Transfekcja pozostają stabilne i mogą być uprawiane dalej.

A common agent for stable transfection is Geneticin, also known as G418, which is a toxin that can be neutralized by the product of the neomycin resistant gene. A wspólne dla agenta jest stabilny Transfekcja Geneticin, znany również jako G418, który jest toksyny, które mogą być neutralizowane przez produkt na neomycynę odpornych genów.

Which Transfection Reagent or Method to Use? Które Transfekcja Reagent lub metodą do użycia?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium Transkrypcja in vitro wymaga oczyszczone linearne DNA szablon zawierający promotor, ribonucleotide triphosphates, bufor systemu, który zawiera DTT i magnezu

Tips for Transfection Porady dla Transfekcja

• Use RNAse inhibitors always! Stosowanie inhibitorów RNAse zawsze!
• Saving Money with T7 RNA Phage Polymerase: Clones with an N-terminal His-6 tag are available. Oszczędność pieniędzy z Phage T7 Polimeraza RNA: klony z N-terminal Jego znacznikiem-6 są dostępne. If you obtain this clone, you can purify large amounts of T7 polymerase with high activity (ref: He B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142–151). Jeśli uzyskać ten klon, można oczyścić dużą ilością T7 polimeraza o wysokiej aktywności (ref: On B, K Rong, Lyakhov D Gartenstein H, G Diaz, Castagna R, McAllister TR, RK DURBIN. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• To remove the DNA template, use an RNAse-free DNAse. Aby usunąć DNA szablon, użyć RNAse wolne DNAse. We have used RQ1 DNase (Promega) added for 15 minutes and it works well. Mamy używany RQ1 DNase (Promega) dodaje do 15 minut i działa dobrze.

Storing Trasfection Reagent Przechowywanie Trasfection Reagent

• RNA is best stored at a neutral pH with EDTA. RNA jest najlepszym przechowywane w neutralnym pH z EDTA.
• TE buffer is recommended (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), however this should be prepared with RNAse free purified (preferablly Millipore water). TE bufor jest zalecane (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA), jednak powinno to być przygotowane z RNAse wolne oczyszczona (preferablly wody Millipore).

Troubleshooting Transfection Problems Rozwiązywanie problemów Problemy Transfekcja

Failed Transfections Niepowodzenie Transfections

• Old transfection reagent Stare Transfekcja odczynnika
• Improperly stored transfection agent Niepoprawnie przechowywane Transfekcja agenta
• Poor quality DNA or vector Niska jakość DNA lub wektora
• Insufficient DNA amount Niewystarczająca ilość DNA
• Insufficient transfection reagent Niewystarczające Transfekcja odczynnika
• Too much DNA Zbyt dużo DNA
• Too much transfection reagent Zbyt dużo Transfekcja odczynnika

References on Transfection Odniesienia na Transfekcja

References on Transfection Odniesienia na Transfekcja

1. Bacchetti S, Graham F (1977). Bacchetti S, M Graham (1977). "Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA". "Transfer genu dla kinazy tymidynę do tymidynę kinazy-niedostateczne ludzkich komórek oczyszczona przez Herpes simplex wirusowego DNA". Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. Proc. Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108. PMID 193108.