Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Bookmark Bookmark Site Bookmark Bookmark Site

Cell Transfection Cell Transfection

This Transfection site is your portal for all things related to the transfection of cells with DNA plasmid or vector, RNA whether siRNA or RNAi, or even recombinant protein. Dette Transfection området er portalen for alle ting relatert til transfection av celler med DNA-plasmid eller vektorgrafikk, RNA enten siRNA eller RNAi, eller til og med rekombinant protein. We provide you with all the background information, protocols for cell transfection, optimization and analysis steps, and cell transfection troubleshooting information to become the ultimate expert! Vi gir deg all den bakgrunnsinformasjon, protokoller til celle transfection, optimalisering og analyse fremgangsmåten, og cellen transfection informasjon om feilsøking for å bli den ultimate ekspert!

Transfection Table of Contents Transfection Innholdsfortegnelse

• What is transfection? Hva er transfection?
• Background Bakgrunn
• Applications Programmer
• Materials Materialer
• Transfection Methods Transfection Metoder
• Buffers Buffer
  
• Preparation Klargjøring
• Protocol Protokoll
• Other T ransfection Protocols Andre T ransfection Protokoller
• Discussion Topics for Transfection Diskusjon Emner for Transfection
• Get Help on your Transfection Problems Få hjelp på Transfection Problemer
• Tips Tips
• Storing Lagring
• Troubleshooting In Transfection Feilsøking i Transfection
• References Referanser

What is Transfection? Hva er Transfection?

Transfection describes the introduction of foreign material into eukaryotic cells using a virus vector or other means of transfer. Transfection beskriver innføring av utenlandsk materiale i eukaryote celler ved hjelp av et virus vector eller andre former for overføring.

The term transfection for non-viral methods is most often used in reference to mammalian cells, while the term transformation is preferred to describe non-viral DNA transfer in bacteria and non-animal eukaryotic cells such as fungi, algae and plants. Begrepet transfection for ikke-viral metoder er mest brukt i referanse til mammalian cellene, mens begrepet transformasjon er foretrukket å beskrive ikke-viral DNA-overføring på bakterier og ikke-animalske eukaryote celler, for eksempel sopp, alger og planter.

Transfection of animal cells typically involves opening transient pores or 'holes' in the cell plasma membrane, to allow the uptake of material. Transfection av animalske celler vanligvis innebærer åpning forbigående porene eller "hull" i cellen plasma membran, slik at uptake av materialet. Genetic material (such as supercoiled plasmid DNA or siRNA constructs), or even proteins such as antibodies, may be transfected. Genetisk materiale (for eksempel supercoiled plasmid DNA eller siRNA constructs), eller selv proteiner som antistoffer, kan være transfected. In addition to electroporation, transfection can be carried out by mixing a cationic lipid with the material to produce liposomes, which fuse with the cell plasma membrane and deposit their cargo inside. I tillegg til electroporation, transfection kan gjennomføres ved å blande en kationiske lipid med materiale til å produsere liposomes, som sikring med cell plasma membrane og deponering deres last innsiden.

The original meaning of transfection was 'infection by transformation', ie introduction of DNA (or RNA) from a eukaryote virus or bacteriophage into cells, resulting in an infection. Den opprinnelige betydningen av transfection var infisert av transformasjon ", dvs. innføring av DNA (eller RNA) fra eukaryote virus eller bacteriophage inn i cellene, noe som resulterer i en infeksjon. Because the term transformation had another sense in animal cell biology (a genetic change allowing long-term propagation in culture, or acquisition of properties typical of cancer cells), the term transfection acquired, for animal cells, its present meaning of a change in cell properties caused by introduction of DNA. Fordi begrepet transformasjon hadde en annen oppfatning i dyre celle biologi (genetiske endringen slik at langsiktige forplantning i kultur, eller oppkjøp av eiendommer typisk av kreft celler), begrepet transfection kjøpt for dyre celler, den nåværende betydningen av en endring i celle egenskaper skyldes innføringen av DNA.

Transfection is a method by which experimental DNA may be put into a cultured mammalian cell. Transfection er en metode som eksperimentelle DNA kan bli satt inn i en cultured mammalian cellen. Such experiments are usually performed using cloned DNA containing coding sequences and control regions (promoters, etc) in order to test whether the DNA will be expressed. Slike eksperimenter er vanligvis utføres ved hjelp av klon DNA inneholder koding sekvenser og kontroll regioner (arrangører, osv.) for å teste om DNA blir uttrykt. Since the cloned DNA may have been extensively modified (for example, protein binding sites on the promoter may have been altered or removed), transfection is often used to test whether a particular modification affects the function of a gene. Siden klon DNA kan ha vært omfattende endret (for eksempel protein bindende områder på arrangøren kan ha blitt endret eller fjernet), transfection er ofte brukt for å teste om en bestemt ombygging påvirker funksjonen av en genet.

Transfection Diagram: Transfection Diagram:

Transfection Applications Transfection Applications

The ability to synthesize RNA in the laboratory is critical to many techniques. Muligheten til å syntetisere RNA i laboratoriet er avgjørende for mange teknikker. Radiolabeled and non-radiolabeled RNA probes are required for many protocols, and they can be synthesized easily in small scale in vitro transcription reactions allowing their use in blot hybridizations and nuclease protection assays. Radiolabeled og ikke-radiolabeled RNA probes er nødvendig for mange protokoller, og de kan være syntetiserte enkelt i liten skala in vitro transkripsjon reaksjoner slik at deres bruk i klatt hybridizations og nuclease beskyttelse essay.

Requirements for Transfection? Krav til Transfection?

• Vector or DNA Vector eller DNA
• Cells Celler
• Transfection Reagent Transfection Reagent

Optimizing Transfection Optimalisering Transfection

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripsjon krever en renset lineære DNA-malen inneholder en arrangøren, ribonucleotide triphosphates, en buffer som inneholder DTT og magnesium

Which Transfection Reagent to Use? Hvilke Transfection Reagent å bruke?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripsjon krever en renset lineære DNA-malen inneholder en arrangøren, ribonucleotide triphosphates, en buffer som inneholder DTT og magnesium

Transfection Methods Transfection Metoder

There are various methods of introducing foreign DNA into a eukaryotic cell. Det finnes ulike metoder for innføring av fremmede DNA i eukaryote celle. Many materials have been used as carriers for transfection, which can be divided into three kinds: (cationic) polymers, liposomes and nanoparticles. Mange materialer har vært brukt som bærere av transfection, som kan deles inn i tre typer: (kationiske) polymerer, liposomes og nanopartikler.

One of the cheapest (and least reliable) methods is transfection by calcium phosphate, originally discovered by FL Graham and AJ van der Eb in 1973[citation needed] (see also [1]). En av de billigste (og minst troverdige) metoder er transfection av kalsiumfosfat, opprinnelig oppdaget av FL Graham og AJ van der Eb i 1973 [sitat] (se også [1]). HEPES-buffered saline solution (HeBS) containing phosphate ions is combined with a calcium chloride solution containing the DNA to be transfected. HEPES-buffered saltløsning løsning (HeBS) inneholder fosfat ionet er kombinert med en Kalsiumklorid løsning som inneholder DNA til å være transfected. When the two are combined, a fine precipitate of the positively charged calcium and the negatively charged phosphate will form, binding the DNA to be transfected on its surface. Når de to er sammen, en fin fremskynde av positivt ladet kalsium og negativt ladet fosfat vil danne forpliktende av DNA til å være transfected på overflaten. The suspension of the precipitate is then added to the cells to be transfected (usually a cell culture grown in a monolayer). Suspensjonen av bunnfall er deretter lagt til cellene til å være transfected (vanligvis en celle kultur vokst i et monolayer). By a process not entirely understood, the cells take up some of the precipitate, and with it, the DNA. Ved en prosess ikke helt forstått, cellene ta opp noen av de styrte, og med det, DNA.

Other methods use highly branched organic compounds, so-called dendrimers, to bind the DNA and get it into the cell. Andre metoder bruker svært branched organiske forbindelser, såkalte dendrimers, til å binde DNA og få det inn i cellen. A very efficient method is the inclusion of the DNA to be transfected in liposomes, ie small, membrane-bounded bodies that are in some ways similar to the structure of a cell and can actually fuse with the cell membrane, releasing the DNA into the cell. En svært effektiv metode er inkluderingen av DNA til å være transfected i liposomes, dvs. små, membran-grenser organer som er på noen måter ligner på strukturen i en celle og kan faktisk sikring med membran, frigjøre DNA inn i cellen . For eukaryotic cells, lipid-cation based transfection is more typically used, because the cells are more sensitive. For eukaryote celler, lipid-cation basert transfection er vanligvis brukt, fordi cellene er mer følsomme.

Another method is the use of cationic polymers such as DEAE-dextran or polyethylenimine. En annen metode er bruk av kationiske polymerer som DEAE-dextran eller polyethylenimine. The negatively charged DNA binds to the polycation and the complex is taken up by the cell via endocytosis. Den negativt ladet DNA binder til polycation og komplekse er tatt opp av cellen via Endocytose.

A direct approach to transfection is the gene gun, where the DNA is coupled to a nanoparticle of an inert solid (commonly gold) which is then "shot" directly into the target cell's nucleus. En direkte tilnærming til transfection er genet gun, hvor DNA er koblet til en nanopartikkel til en inert solid (vanligvis gull) som deretter blir "skutt" direkte inn i målet celle kjernen. DNA can also be introduced into cells using viruses as a carrier. DNA kan også bli introdusert i cellene ved hjelp av virus som transportør. In such cases, the technique is called viral transduction, and, the cells are said to be transduced. I slike tilfeller er teknikken kalles viral transduction, og cellene er sagt å være transduced.

Other methods of transfection include nucleofection, electroporation, heat shock, magnetofection and proprietary transfection reagents such as Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene or DreamFect. Andre metoder for transfection inkludere nucleofection, electroporation, varme sjokk, magnetofection og proprietære transfection reagenser som Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene eller DreamFect.

Stable vs Transient Transfection Methods Stabil vs Transient Transfection Metoder

For most applications of transfection, it is sufficient if the transfected gene is only transiently expressed. For de fleste anvendelser av transfection, er det tilstrekkelig dersom transfected genet er bare transiently uttrykt. Since the DNA introduced in the transfection process is usually not inserted into the nuclear genome, the foreign DNA is lost at the later stage when the cells undergo mitosis. Siden DNA innført i transfection prosessen er vanligvis ikke settes inn i den kjernefysiske genome, utenriks-DNA er tapt ved senere stadium når cellene gjennomgår Mitose. If it is desired that the transfected gene actually remains in the genome of the cell and its daughter cells, a stable transfection must occur. Hvis det er ønskelig at transfected genet faktisk fortsatt i genome av cellen og sin datter celler, en stabil transfection må skje.

To accomplish this, another gene is co-transfected, which gives the cell some selection advantage, such as resistance towards a certain toxin. For å oppnå dette, en annen genet er co-transfected, som gir cellen noen valg fordel, for eksempel motstand mot en viss Toxin. Some (very few) of the transfected cells will, by chance, have inserted the foreign genetic material into their genome. Noen (veldig få) av transfected cellene vil, etter sjanse, har satt inn utenlandsk genetisk materiale i sine genome. If the toxin, towards which the co-transfected gene offers resistance, is then added to the cell culture, only those few cells with the foreign genes inserted into their genome will be able to proliferate, while other cells will die. Hvis Toxin, mot som co-transfected genet gir resistens, er deretter lagt til cellen kultur, bare de få cellene med utenlandske gener settes inn i sine genome vil være i stand til å sprer, mens andre celler vil dø. After applying this selection pressure for some time, only the cells with a stable transfection remain and can be cultivated further. Etter bruk dette valget press for noen tid, bare celler med en stabil transfection fortsatt og kan dyrkes videre.

A common agent for stable transfection is Geneticin, also known as G418, which is a toxin that can be neutralized by the product of the neomycin resistant gene. En felles agent for stabil transfection er Geneticin, også kjent som G418, som er en Toxin som kan neutralized av produktet av neomycin motstandsdyktig genet.

Which Transfection Reagent or Method to Use? Hvilke Transfection Reagent eller metode å bruke?

In vitro transcription requires a purified linear DNA template containing a promoter, ribonucleotide triphosphates, a buffer system that includes DTT and magnesium In vitro transkripsjon krever en renset lineære DNA-malen inneholder en arrangøren, ribonucleotide triphosphates, en buffer som inneholder DTT og magnesium

Tips for Transfection Tips for Transfection

• Use RNAse inhibitors always! Bruk RNAse hemmende alltid!
• Saving Money with T7 RNA Phage Polymerase: Clones with an N-terminal His-6 tag are available. Spare penger med T7 RNA Phage Polymerase: Clones med en N-terminal Hans-6-koden er tilgjengelig. If you obtain this clone, you can purify large amounts of T7 polymerase with high activity (ref: He B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein Expr Purif. 1997, 9, 142–151). Hvis du får tak i denne klone, kan du rense store mengder T7 polymerase med høy aktivitet (ref: Han B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister WT, Durbin RK. Protein expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• To remove the DNA template, use an RNAse-free DNAse. For å fjerne DNA-malen, kan du bruke en RNAse-DNAse. We have used RQ1 DNase (Promega) added for 15 minutes and it works well. Vi har brukt RQ1 DNase (Promega) lagt til 15 minutter, og det fungerer godt.

Storing Trasfection Reagent Lagring Trasfection Reagent

• RNA is best stored at a neutral pH with EDTA. RNA er best lagret på en nøytral pH med EDTA.
• TE buffer is recommended (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA), however this should be prepared with RNAse free purified (preferablly Millipore water). TE buffer er anbefalt (10 mm Tris-HCL, pH 7,5, 1 mm EDTA), men dette bør være forberedt med RNAse gratis renset (preferablly Millipore vann).

Troubleshooting Transfection Problems Feilsøking Transfection Problemer

Failed Transfections Kunne Transfections

• Old transfection reagent Old transfection reagent
• Improperly stored transfection agent Improperly lagret transfection agent
• Poor quality DNA or vector Dårlig kvalitet DNA eller vektorgrafikk
• Insufficient DNA amount Utilstrekkelig DNA beløp
• Insufficient transfection reagent Utilstrekkelig transfection reagent
• Too much DNA For mye DNA
• Too much transfection reagent For mye transfection reagent

References on Transfection Referanser på Transfection

References on Transfection Referanser på Transfection

1. Bacchetti S, Graham F (1977). Bacchetti S, Graham F (1977). "Transfer of the gene for thymidine kinase to thymidine kinase-deficient human cells by purified herpes simplex viral DNA". "Overføring av genet for thymidine kinase til thymidine kinase-mangelfull menneskelige celler av renset herpes enkel virus-DNA". Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. Proc Natl Acad Sci USA 74 (4): 1590-4. PMID 193108. PMID 193108.