Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

RNA Protocols RNA Protokoller

RNA Encyclopedia RNA Encyclopedia

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatikk

RNA Forum RNA Forum

RNA Blog RNA-blogg

RNA News RNA Nyheter

RNA Isolation RNA Isolation

RNA Extraction Background Information RNA Utvinning Bakgrunnsinformasjon

Obtaining high quality, intact RNA is the first and often the most critical step in performing many fundamental molecular biology experiments, including Northern analysis, nuclease protection assays, RT-PCR, RNA mapping, in vitro translation and cDNA library construction. Hente høy kvalitet, intakt RNA er den første og ofte den mest kritiske trinnet i å utføre mange grunnleggende molekylærbiologi eksperimenter, inkludert Nord-analyse, nuclease beskyttelse essay, RT-PCR, RNA kartlegging, in vitro oversettelse og cDNA bibliotek konstruksjon. To be successful, however, the RNA isolation procedure should include some important steps both before and after the actual RNA purification. For å være vellykket, men det RNA isolering prosedyren bør inneholde noen viktige skritt både før og etter selve RNA rensing.

Basic RNA Isolation Methods Basic RNA Isolation Metoder

Depending on the RNA to be extracted, there are properties of RNA that allow it to be isolated away from other cellular materials such as proteins, DNA and even lipids. Avhengig av RNA for å bli hentet, det er egenskaper av RNA som tillater det å være isolert bort fra andre cellular materialer som for eksempel proteiner, DNA og til og med lipider.

Messenger RNA or mRNA contains a stretch adenosine residues in the form of a poly(A) tail. Messenger RNA eller mRNA inneholder en strekning adenosine rester i form av en polygon (A) hale. This has been exploited to allow mRNA to be bound to poly(T) affinity columns or beads. Dette har blitt utnyttet til å tillate mRNA å være bundet til polygon (T) tilhørighet kolonner eller perler.

Tips for RNA Extraction and Isolation Tips for RNA Utvinning og Isolation

If you currently have a preferred method for isolating RNA, continue to use it. Hvis du har en foretrukket metode for å isolere RNA, fortsette å bruke det.

If you haven't isolated RNA from your system before and your organism is not on the following list, we can help you identify established protocols that have been used for isolating RNA for Northern blotting or RT-PCR from your system. Hvis du ikke har isolert RNA fra systemet før og din organisme er ikke på listen nedenfor, kan vi hjelpe deg med å identifisere etablerte protokoller som har blitt brukt for å isolere RNA for Northern blotting eller RT-PCR fra systemet ditt. These types of protocols will also yield "microarray-grade" RNA. Disse typer protokoller vil også gi "microarray-grade" RNA.

Always run an agarose gel of your RNA to assess the quality. Alltid kjøre en agarose gel av RNA til å vurdere kvaliteten.

NOTE: If you use a non column based purification reagent such as TRIzol we recommend you precipitate your RNA a second time from ethanol or you pass it through an Rneasy column or similar device. MERK: Hvis du bruker et ikke-kolonnen basert rensing reagent som TRIzol anbefaler vi at du fremskynde din RNA en gang fra etanol eller du passerer det gjennom en Rneasy kolonne eller tilsvarende enhet. This insures removal of all organic contaminants (See spectra below). Dette sikrer fjerning av alle organiske forurensninger (Se Spectra nedenfor).

RNase Inhibitors Used in RNA Extraction and Isolation RNase hemmende Brukt i RNA Utvinning og Isolation

Checking RNA Isolation Quality and Quantity Sjekke RNA Isolation kvalitet og kvantitet

Efficient nuclear/cytoplasmic fractionation can be quickly assessed by denaturing agarose gel analysis (see Figure 1). Effektiv kjernefysiske / cytoplasmic fractionation kan raskt vurderes av denaturing agarose gel analyse (se figur 1). Bands correspond-ing to precursor rRNA should be equivalent in the total and nuclear RNA fraction. Bands korrespondere-ing til forløperen rRNA bør være tilsvarende i den totale og kjernefysiske RNA brøkdel. The 18S and 28S rRNA bands will be less intense in the nuclear RNA fraction than in either total RNA or cytoplasmic fraction RNA. The 18s og 28s rRNA band vil være mindre intens i kjernefysiske RNA brøkdel enn i enten total RNA eller cytoplasmic brøkdel RNA. In some cell lines, for example 293 and COS-7 cells, this difference will be dramatic, but in other cells lines such as HeLa cells, the rRNA bands are only slightly less intense in nuclear RNA than in total or cytoplasmic fraction RNA." I enkelte cellen linjer, for eksempel 293 og COS-7 celler, denne forskjellen vil være dramatiske, men i andre celler linjer som hela celler, rRNA band er bare litt mindre intens i kjernefysiske RNA enn i hele eller cytoplasmic brøkdel RNA.

RNA Purity RNA Purity

A260 readings and 260/280 ratios are not enough to ensure high purity RNA. A260-og 260/280 Nøkkeltall er ikke nok til å sikre høy renhet RNA. You must take a full UV spectrum. Du må ta en full UV-spekteret. Below are 3 example spectra which all have good 260/280 ratios, but have very different purities. Nedenfor er 3 eksempel Spectra som alle har gode 260/280 Nøkkeltall, men har svært forskjellige purities. You can also use the 260/230 ratio to help determine the amount of organic contamination in your RNA. Du kan også bruke 260/230 system for å fastslå mengden av organisk forurensning i RNA. It is a much more variable number than the 260/280 ratio, but generally, ratios above 1 indicate good purity. Det er en mye mer variabel nummer enn 260/280 system, men generelt sett Nøkkeltall over 1 indikerer god renhet.

Quantifying RNA Extraction and Isolation Quantifying RNA Utvinning og Isolation

RNA Isolation from Subcellular Fractions RNA Isolation fra Subcellular Brøker

Cells were then washed in PBS and successively extracted as described. Celler ble deretter vasket i PBS og stadig trekkes ut som beskrevet. First, cells were extracted with the Nonidet P-40 buffer (10 mM Tris-Cl, (pH 7.5), 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). Først cellene ble hentet med Nonidet P-40 buffer (10 mm Tris-Cl, (pH 7,5), 10 mm NaCl, 3 mm MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mm DTT). The remaining pellet (rough endoplasmic reticulum (RER) and nucleus) was washed in the same buffer and extracted in buffer B (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 mM EDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De resterende pellet (grov endoplasmic nettet (RER) og nucleus) ble vasket i samme buffer og hentet inn buffer B (10 mm Tris-Cl (pH 7,5), 10 mm NaCl, 0,5% (v / v) Nonidet P-40 , 40 mm EDTA, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mm DTT). The remaining nuclear pellet was washed in the same buffer and extracted with high salt buffer (10 mM Tris-Cl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5%(v/v) Nonidet P-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mM DTT). De gjenværende kjernefysiske pellet ble vasket i samme buffer og hentet med høyt salt buffer (10 mm Tris-Cl (pH 7,5), 0,5 M NaCl, 3 mm MgCl2, 0,5% (v / v) Nonidet P-40, 40 enheter / ml Rnasin, 1 mm DTT). RNA was purified from each fraction by the RNA STAT solution. RNA ble renset fra hver fraksjon av RNA STAT løsning. Total RNA was isolated using the RNA-STAT60 reagent (Tel-test) according to the instructions provided by the manufacturer. Total RNA ble isolert ved hjelp av RNA-STAT60 reagent (Tel-test) i henhold til instruksjonene som er gitt av produsenten. (Reference: Byeong-Churl Jang et al., 2002) (Referanse: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

RNA Isolation Using CsCl Protocol RNA Isolation Bruke CsCl Protocol

Chaos Buffer for RNA isolation Kaos buffer til RNA isolering

For 100 mls 200 mls For 100 mls 200 mls

4. 5M Guanidinium thiocyanate 53.2 g 106.4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM EDTA 0.5M 10 mls 20 mls 25mM Tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls 5M Guanidinium thiocyanate 53,2 g 106,4 2% N-lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mm EDTA 0,5 m 10 mls 20 mls 25mm Tris-HCL, pH 7,5 1M 2,5 mls 5 mls

0. 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls 1M b-mercaptoethanol 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul

5. 7 M CsCl cushion* Final Volume 100 ml 7 M CsCl pute * Final Volum 100 ml

5. 7 M "Baked" CsCl 95.8g 7 M "bakt" CsCl 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls 1M EDTA 0,5 m 20 mls

RNA Extraction Procedure Using CsCl RNA Utvinning prosedyre Bruke CsCl

* Use DEPC treated water and baked glassware. * Bruk DEPC behandlet vann og bakt glass. This solution, absolutely, positively must be Rnase free. Denne løsningen, helt, positivt må Rnase gratis. Rnase is everywhere! Rnase er overalt! Wear gloves, use only baked glassware, or virgin plastic. Bruk hansker, bruker bare bakt glass, eller virgin plast. DePC treat your water, buffers (except Tris). DePC behandle vann, buffere (unntatt Tris). Be very careful. Vær svært forsiktig.

1. Weigh animal. Weigh dyr. Remove organ (liver), weight One of the superior attributes of cDNA is you reduce the gene complexity by choosing an organ that only expresses a single locus of a multilocus enzyme. Fjern organ (leveren), vekt En av de overlegne egenskaper av cDNA er du redusere genet kompleksiteten ved å velge et organ som bare uttrykker en enkelt plass i en multilocus enzymet. 2 . 2. Homogenize tissue rapidly in "Chaos" buffer (9mls) 3 . Homogenize vevet raskt i "Kaos" buffer (9mls) 3. Spin homogenant at 12 KG to remove insoluble material 4 . Spin homogenant på 12 kg for å fjerne uløselig materiale 4. WHILE Homogenant IS SPINNING 4A. MENS Homogenant IS spinning 4A. Weight out 1.8 g of CsCl (0.2g/ml) per sample. Vekt ut 1,8 g av CsCl (0.2g/ml) per prøve. 4B. In the ultra-centrifuge tube ("quick-seal") add 3.5mls of 5.7M CsCl "cushion" This layer must be Rnase free. I ultra-centrifuge tube ( "quick-segl") legger 3.5mls av 5.7M CsCl "pute" Dette laget må være Rnase gratis. You will centrifuge your RNA through this layer and any contamination will cause significant losses. Du vil centrifuge din RNA gjennom dette laget og eventuell forurensning vil føre til betydelige tap. 5 . 5. Remove supernant, put into fresh tube, add 1.8 g CsCl 6 . Fjern supernant, satt i fersk tube, legger 1,8 g CsCl 6. Carefully, add homogenant on top of the CsCl cushion. Nøye, legger homogenant på toppen av CsCl pute. This is most readily accomplished by using a 10cc syringe and long needle. Dette er mest lett oppnås ved å bruke en 10cc sprøyte og lang pinne. Place needle/syringe into quick-seal tube, and add tissue homogenant to the syringe. Place nål / sprøyte inn raskt segl tube, og legge til vev homogenant til sprøyte. Homogenant will slowly trickle into QS tube, floating on top of the cushion. Homogenant vil sakte sakte i QS tube, flytende på toppen av pute.

7. Carefully, balance matched pairs of centrifuge tube (+/-0.005 g). Nøye, balanse Matchet par centrifuge tube (+ / -0,005 g).

8. Seal tubes, place matched tubes opposite of each other and cap with red aluminum tops. Seal-rør, plasserer Matchet tuber motsatte av hverandre og cap med rød aluminium topper.

9. Centrifuge, 50,000 rpms 5.5 hrs, 20oC Centrifuge, 50.000 RPMer 5,5 timer, 20oC

After centrifugation: Mark tubes where pellet should be: on the bottom outer side (relative to center of rotor) Etter centrifugation: Mark tuber hvor kulene bør være: på bunnen yttersida (i forhold til midten av rotoren)

10. Remove tubes, place in convenient rack. Fjern rør, i praktisk rack.

11. Slice off the top of tube.Aspirate off the top 2/3- 3/4 of solution. Stykke av toppen av tube.Aspirate av toppen 2/3- 3 / 4 av løsningen. WORK FROM THE TOP DOWN. ARBEID fra toppen og ned. IT IS IMPORTANT THAT YOU ASPIRATE OFF THE UPPER MOST SOLUTION FIRST AND REMOVE ALL BUT THE CLEAR CUSHION. Det er viktig at du ASPIRATE OFF øvre MEST LØSNING først og fjerner alle bortsett fra de klare pute. DO NOT ASPIRATE THE INVISIBLE PELLET AT THE BOTTOM. IKKE ASPIRATE The Invisible pellet på bunnen.

12. Cut off the top 2/3 of tube. Klipp av toppen 2 / 3 av tube. Using a "pulled" Pasteur pipet, carefully remove remaining solution. Ved hjelp av en "trakk" Pasteur pipet, nøye fjerne gjenværende løsning. The pellet will be on the bottom-side of the tube. Den pellets vil være på den nedre side av røret.

13. Rinse pellet with 70% EtOH, remove (use Pasteur pipets), repeat twice (total 3 washes) Skyll pellet med 70% EtOH, fjerner (bruk Pasteur pipets), gjenta to ganger (totalt 3 vasker)

14. Add 200 ul of 0.1x TE (RNase free), using the pipet tip to crush pellet and "titrating" TE attempt to put pellet into solution. Legg til 200 ul av 0.1x TE (RNase gratis), ved hjelp av pipet spissen for å knuse kulene og "titrating" Te forsøker å sette kulene inn i løsningen. At least form a heterogeneous solution and put into a fresh microfuge tube. Minst utgjør en heterogen løsning og satt i en fersk microfuge tube.

15. Repeat with 200 ul of TE pooling both solutions Gjenta med 200 ul av TE pooling begge løsninger

16. Vortex, good RNA does not like to go into solution. Vortex, god RNA liker ikke å gå inn i løsningen. Patience is a virtue. Tålmodighet er en dyd.

17. Determine concentration, 10 ul into 490 ul (500 ul final vol) Bestem konsentrasjonen, 10 ul til 490 ul (500 ul endelige vol)

18. Remove 1 to 2 ug of RNA for gel analysis (add RNA loading buffers) Fjern 1 - 2 ug av RNA gel for analyse (legg til RNA lasting buffere)

19. Add 1/10 volume Rnase free 3M NaOAC (40 ul), 2.5 volumes of EtOH (1.0ml). Legg til 1 / 10 volum Rnase gratis 3M NaOAC (40 ul), 2,5 mengder EtOH (1.0ml). Mix vigorously. Mix vigorously.

20. You can calculate the concentration of RNA in the EtOH.Thus, there is no need to precipitate all of your RNA at once. Du kan beregne konsentrasjonen av RNA i EtOH.Thus, er det ikke nødvendig å føre alle dine RNA samtidig. Just remove about 1.5 to 2 times the amount you need by vortexing EtOH/RNA solution and remove the appropriate volume. Bare fjerne ca 1,5 - 2 ganger det beløpet du trenger av blanding EtOH / RNA løsning og fjerne de aktuelle volum. This EtOH/RNA solution stored at 20oC or lower, is stable for years. Dette EtOH / RNA løsning lagret på 20oC eller lavere, er stabil i mange år.

See: Se:

RNA Protocols RNA Protokoller

RNA Bioinformatics RNA Bioinformatikk