Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protokoller

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkter

Western Blot Books Western Blot Bøker

Western Blot Troubleshooting Western Blot Feilsøking

Western Blot Books Western Blot Bøker

See also: Related Links to External Sites: Western Blot Se også: Relaterte linker til eksterne nettsteder: Western Blot

Western Blot Western Blot

AUDIO : Listen to a detailed Western Blot Explanation ! Courtesy: National Human Genome Research Institute. Lyd: Lytt til en detaljert Western Blot Standardtegn! Courtesy: National Human Genom Research Institute.

Western Blot Definition: Western blotting is a technique used to identify and locate proteins based on their ability to bind to specific antibodies. Western Blot Definisjon: Western blotting er en teknikk som brukes til å identifisere og finne proteiner basert på deres evne til å binde til spesifikke antistoffer.

Western blot analysis can detect your protein of interest from a mixture of a great number of proteins.  Western blotting can give you information about the size of your protein (with comparison to a size marker or ladder in kDa), and also give you information on protein expression (with comparison to a control such as untreated sample or another cell type or tissue). Western blot analyser kan oppdage din protein av interesse fra en blanding av et stort antall proteiner. Western blotting kan gi deg informasjon om størrelsen på protein (med sammenligning til en størrelse markør eller stige i kda), og også gi deg informasjon om protein expression (med sammenligning til en kontroll, for eksempel ubehandlet prøve eller en annen celle type eller vev).

Summary: Western Blot Gives You Information on the: Sammendrag: Western Blot gir deg informasjon om:

Western blot analysis can analyze any protein sample whether from cells or tissues, but also can analyze recombinant proteins synthesized in vitro. Western blot is dependent on the quality of antibody you use to probe for your protein of interest, and how specific it is for this protein. Antibodies are now easily obtainable from commercial sources, and you can purchase one for your protein of interest. Western blot analyse kan analysere eventuelle protein eksemplar enten fra celler eller vev, men kan også analysere rekombinant syntetiserte proteiner in vitro. Western blot er avhengig av kvaliteten på antistoffet du bruke til å sondere for protein av interesse, og hvordan bestemte det er for denne protein. antistoffer er nå lett tilgjengelig fra kommersielle kilder, og du kan kjøpe en for protein av interesse. If your protein is a novel protein, you must produce an antibody yourself or get a company to do it for you. Hvis proteinet er en roman protein, må du lage en antistoffet deg selv eller få et firma til å gjøre det for deg. In this case you will need at least a small amount of your protein either purified from cell extracts or made as a recombinant (ie in vitro or in a recombinant protein expression system ). Antibodies specific to your protein are vital to western blotting as they are able to bind specifically to your protein of interest instead of the thousands of proteins on your western blot! I dette tilfellet vil du trenge minst en liten mengde av protein enten renset fra celle ekstrakter eller gjort som en rekombinante (dvs. in vitro eller i et rekombinant protein expression system). Antistoffer spesifikke for protein er avgjørende for western blotting som de er stand til å binde spesifikt til protein av interesse i stedet for tusenvis av proteiner på western blot!

Figure 1. Figur 1. Details of the steps involved in obtaining protein for western blot. Detaljer om fremgangsmåten involvert i å skaffe protein til western blot.

Figure 2. Figur 2. Figure detailing the steps in conducting a western blot. Figur detaljering trinnene i å gjennomføre en western blot.

[ Top ] [Top]

How Does Western Blotting Work? Hvordan virker Western Blotting?

See Diagram 1 below. Se diagram 1 nedenfor. First things first. Første ting først. Obtain a protein sample you want to analyze, such as cell samples. Få tak i en protein eksemplar du vil analysere, for eksempel celle vareprøver. Lyse the cells to release protein contents. Lyse cellene for å frigi protein innholdet. Run these on a gel which separates proteins on the basis of size. Kjør disse på en gel som skiller proteiner på grunnlag av størrelse. Then transfer these gel proteins onto a membrane using electricity. Deretter overfører disse gel proteiner på en membran ved hjelp av elektrisitet. This membrane can then be used to probe for proteins of interest using a primary antibody. Denne membranen kan deretter brukes til å sondere for proteiner av interesse ved hjelp av en primær antistoff.

What You Need to Western Blot: Hva du trenger for å Western Blot:

Western blot relies on the primary antibody to detect this protein from the thousands of proteins on your membrane and previously on your gel! Western blot er avhengig av den primære antistoffet til å gjenkjenne denne protein fra tusenvis av proteiner i membranen og tidligere på gel! (a cell can contain 30,000 different proteins - and these same proteins can even be altered giving you over 300,000 different proteins!). (en celle kan inneholde 30000 ulike proteiner - og de samme proteiner kan også endres slik at du er over 300000 forskjellige proteiner!). Using an antibody recognizes your primary antibody (a secondary antibody) you build up a protein-antibody-antibody sandwich!  The secondary antibody has a horse radish peroxidase enzyme which converts a luminol substrate to a light releasing substance! Ved hjelp av en antistoffet gjenkjenner den primære antistoffet (en sekundær antistoff) du bygge opp et protein-antistoff-antistoff sandwich! Sekundære antistoffet har en hest reddik peroxidase enzym som konverterer en luminol underlaget til en lys Slipp stoff! This light is detected as a spot on film. Dette lyset er registrert som et punkt på film. From this spot you can determine how much protein is there relative to other spots, or the size of the protein relative to a size marker that is run also on the gel. Fra dette punktet kan du finne ut hvor mye protein er det i forhold til andre steder, eller størrelsen på protein i forhold til en størrelse som kjøres også på gel.

Diagram 2 shows a western blot example gel. Diagram 2 viser en western blot eksempel gel. Lane 1 is a protein size marker ladder which shows different known sizes of proteins, this can be purchased commercially and the sizes of all the spots are given in a pamphlet. Lane 1 er et protein size markør stige som viser forskjellige kjente størrelser av proteiner, dette kan kjøpes kommersielt og størrelsene på alle stedene er gitt i heftet. Lane 3 is a cancer sample and lane 5 is a normal sample. Lane 3 er en kreft-prøve og felt 5 er et normalt eksemplar. As you can see the protein in lane 3 has a higher expression than the cancer sample in lane 5, which is interesting. Som du kan se protein i felt 3 har en høyere uttrykk enn kreft eksemplar i felt 5, som er interessant. Also, the protein spots in lanes 3 and 5 are the same size as the 2nd spot in the size ladder from lane 1. Also, the protein kapasitet på baner 3 og 5 er samme størrelse som 2nd spot i størrelse stige fra felt 1. We can then look at the known protein size from our brochure which we received with the ladder. Vi kan deretter se på de kjente protein størrelse fra vår brosjyre som vi fikk med vegen. We then determine that the size of the protein is 80 kDa. Vi deretter fastslå at størrelsen på protein er 80 kda. Our protein of interest is also 80 kDa. Våre protein av interesse er også 80 kda. So we know that the western blot worked and that the protein is highly expressed in a cancer sample! Så vi vet at den vestlige klatt arbeidet og at protein er høyt uttrykt i en kreft-prøve!

To Detect your Protein: Til å gjenkjenne dine Protein:

[ Top ] [Top]

Diagram 1. Diagram 2. Diagram 1. Diagram 2.

Now Learn everything else there is about western blots! Nå Lær alt annet er det om western blots!

[ Top ] [Top]

Table of Contents , in order done for western blot: Innholdsfortegnelse, for gjort for western blot:

Steps in Western Blotting : Skritt i Western Blotting:

- Preparing for Western Blot -- Klargjør for Western Blot

- Which Antibody to use for Western Blots -- Hvilken Antibody til bruk for vestlige Blots

- Lysing Cells for Western Blot -- Lysing celler for Western Blot

- SDS-PAGE Gel Information -- SDS-PAGE Gel Informasjon

- SDS-PAGE Gel Preparation for Western Blots -- SDS-PAGE Gel Klargjøring for Vest Blots

- Gel Electrophoresis - running the gel -- Gel Electrophoresis - kjører gel

- Tranfer of Proteins to Membrane for Western Blotting -- Tranfer av proteiner til Membran for Western Blotting

- Western Blot -- Western Blot

Terms and Definitions used in Western Blot Analysis Termer og definisjoner som brukes i Western Blot analyse

Latest Western Blot Topics ! Siste Western Blot emner!

[ Top ] [Top]

Steps in Western Blot Analysis: Skritt i Western Blot analyse:

- Sample Prepartation -- Sample Prepartation

- Lysing Buffer -- Lysing buffer

- Antibody -- Antibody

- Lysing Cells -- Lysing Celler

- Gel Preparation -- Gel Klargjøring

- Running Gel -- Kjører Gel

- Transfer of Gel -- Overføring av Gel

- Controls -- Kontroller

- Western Blot -- Western Blot

- Readout -- Readout

- Analysis and Interpretation -- Analyse og tolkning

[ Top ] [Top]

To Prepare Samples for Western Blot: Å forberede Vareprøver for Western Blot:

Whether you have Non-adherent Cells (such as T-cell lines or peripheral blood cells) or Adherent cells (such as Fibroblast cells or COS cells), you need to remove extraneous proteins from the media. Enten du har Non-tilhenger celler (for eksempel T-cellen linjer eller perifert blod celler) eller tilhenger celler (for eksempel Fibroblast celler eller COS celler), må du fjerne overflødig proteiner fra media. For non-adherent cells you can gently pellet them with centrifugation and then wash the pellet with PBS. For ikke-tilhenger cellene kan du forsiktig pellet dem med centrifugation og deretter vaske pellet med PBS. For adherent cells, simple wash the flask or dish with PBS prior to western blot. For tilhenger celler, enkel vask av flaske eller fat med PBS før western blot.

Western blot analysis examines proteins, and so we want the proteins to be release from the cells and also prevent the proteins from being cut up by proteases. Western blot analyser undersøker proteiner, og så ønsker vi at proteiner skal slippe fra cellene og også forhindre at proteiner fra å bli kuttet opp av proteases. We need these to western blot: Vi trenger disse for western blot:

- to keep things cold! -- Å holde ting kaldt! 4C on ice during cell lysis for western blotting 4C på isen under celle lysis for western blotting

- use Detergent to break up membranes of cells to release proteins -- Bruke vaskemiddel for å bryte opp membraner i cellene for å frigi proteiner

- Buffer -- Buffer

- Inhibitors (both protease inhibitors and phosphatase inhibitors if we will do western blot for phospho-proteins) -- Hemmere (både Protease hemmere og phosphatase hemmende hvis vi vil gjøre western blot for phospho-protein)

Detergent - Lysing Cells For Western Blot Vaskemiddel - Lysing celler for Western Blot

SDS and RIPA are detergents that are used to solubilize proteins for later analysis using western blotting. SDS og Ripa er vaskemidler som brukes til å solubilize proteiner for senere analyse ved hjelp av western blotting. This is required as many proteins are either inside the cell or located inside cell membranes, so we need to release these proteins to be able to immunoblot for them. Dette er nødvendig så mange proteiner er enten inne i cellen eller befinner seg i cellen membraner, så vi trenger for å frigi disse proteiner for å kunne immunoblot for dem.

[ Top ] [Top]

Which Antibody should I use for Western Blotting? Hvilke Antibody bør jeg bruke for Western Blotting?

You should select an Antibody to use for Western Blot. Usually either mouse monoclonal antibodies or rabbit polyclonal antibodies are used. Du bør velge en Antibody å bruke for Western Blot. Vanligvis enten musen monoclonal antistoffer eller kanin polyclonal antistoffer er brukt.

You can use either an antibody without any added groups, or use an antibody which is conjugated to biotin. Du kan bruke enten en antistoffer uten noen ekstra grupper, eller bruke et antistoff som er conjugated til Biotin. These antibodies do not require Disse antistoffer ikke krever

Polyclonal vs Monoclonal Antibodies for Western Blot Polyclonal kontra Monoclonal antistoffer for Western Blot

Monoclonal Antibodies are usually better for Western Blotting due to: Monoclonal antistoffer er vanligvis bedre for Western Blotting grunn til:

- better signal to noise ratio ( lower background in western blot ) -- Bedre signal til støy forholdet (lavere bakgrunn i western blot)

- their higher specificity ( you get less contaminating proteins or Ig ) -- Deres høyere spesifiserer (du får mindre forurensende proteiner eller Ig)

- overall cleaner results on the western blotting film (less non-specific bands detected) -- Samla renere resultater på western blotting film (mindre ikke-spesifikke band oppdaget)

Polyclonal Antibodies are better suited for Immunoprecipitation: Polyclonal antistoffer er bedre egnet for Immunoprecipitation:

- they recognize more epitopes -- De gjenkjenner mer epitopes

- have higher avidity -- Har høyere avidity

[ Top ] [Top]

Lysing Cells for Western Blot: Lysing celler for Western Blot:

TIPS before you lyse for western blotting: TIPS før du lyse for western blotting:

If you are going to western blot for protein mass (ie a protein that is not phosphorylated): Hvis du skal western blot for protein masse (dvs. en protein som ikke er phosphorylated):

- you can lyse in larger volumes (keeping the rest to blot for other proteins) -- Du kan lyse i større volumer (holde resten blot for andre proteiner)

If you are going to western blot a phospho-protein (or phosphorylated protein) it is important to do the following: Hvis du skal western blot en phospho-protein (eller phosphorylated protein) er det viktig å gjøre følgende:

- make sure you use phosphatase inhibitors ( such as vanadate because phosphatases will remove the phosphates from your proteins! ) -- Vær sikker på at du bruker phosphatase hemmere (for eksempel vanadate fordi phosphatases vil fjerne fosfater fra proteiner!)

- also lyse cells in the smallest volume possible ( ie lyse in 100 ul loading buffer, this is done because you can load most of the cells you lysed. This is important as signal is quite weak when western blotting for phospho-proteins.) -- Også lyse cellene i det minste volum mulig (dvs. lyse i 100 ul lasting buffer, dette er gjort fordi du kan laste de fleste av cellene du lysed. Dette er viktig som signal er ganske svake når western blotting for phospho-protein.)

If you are looking at protein-protein interactions : Hvis du ser på protein-protein samhandling:

- do not use SDS as it dissociates protein-protein interactions and thus proteins are denatured (especially after boiling) -- Ikke bruk SDS som det dissociates protein-protein interaksjoner og dermed proteiner er denatured (spesielt etter kokes)

- for western blotting protein-protein interactions, ie native interactions you must use a less-stringent detergent such RIPA. -- For western blotting protein-protein interaksjoner, dvs. optimal samhandling må du bruke en mindre strenge vaskemiddel slike Ripa.

Lysing: Lysing:

- can be done directly on the plate or dish -- Kan gjøres direkte på platen eller tallerken

- pellet the cells -- Pellets cellene

- Keep on Ice and cold - use an ice bucket -- Keep on Ice og kaldt - bruk en is bøtte

- Rule of thumb for how much lysis buffer to use is: 10^5 cells / uL of lysis buffer -- Tommelfingerregel for hvor mye lysis buffer til å bruke er: 10 ^ 5 celler / ul av lysis buffer

- collect in eppendorf tubes and label ( keep these on ice ) -- Samle inn i eppendorf rør og etiketten (beholde disse på isen)

Measure total protein before Western Blot Analysis: Mål totalt protein før Western Blot analyse:

- this allows more quantitative analysis if you want to compare treatment conditions in western blot analysis -- Det gir mer kvantitativ analyse hvis du ønsker å sammenligne behandling forholdene i western blot analyse

- commercial kits are available such as a Bradford assay for measuring total protein (from Bio-Rad) -- Kommersielle kits are available for eksempel en Bradford-analysen for måling av total protein (fra Bio-Rad)

- 0.1% of SDS or greater can interfere with protein measurement -- 0,1% av SDS eller større kan forstyrre protein måling

Denature Protein Samples : Denature Protein Eksempler:

- add protein loading sample buffer to an aliquot of cell lysate - contains dye (too see the migration on a gel, 2% SDS) -- Legge til protein lasting sample buffer til en aliquot av cellen lysate - inneholder fargestoff (for se migreringen på en gel 2% SDS)

- add disulfide reducing agent such as beta - mercaptoethanol -- Legge til disulfide reduksjon som beta - mercaptoethanol

- Boil in water bath or heating block (lower temperatures such as mid - 90 degrees decrease protein aggregation ). -- Koke i vannbad eller oppvarming blokkere (lavere temperaturer som midten - 90 grader redusere protein aggregeres).

- Poke a hole in cap of each tube to prevent popping -- Rote i et hull i korken på hver tube for å hindre spratt

SDS-PAGE Gel Information for Western Blotting SDS-PAGE Gel Informasjon for Western Blotting

SDS-PAGE Gels are gel matrices which are used to separate proteins by size in the presence of electric current. SDS-PAGE Gels er gel matriser som er brukt til å skille proteiner etter størrelse i nærvær av elektrisk strøm. Low percentage gels separate larger proteins whereas higher percentage gels separate smaller proteins better. Lav prosentandel gels separate større proteiner mens høyere prosentandel gels separate mindre proteiner bedre. The problem is that all proteins have a charged associated with them, and in an electrical current this could cause problems. Problemet er at alle proteiner har en belastet forbundet med dem, og i en elektrisk strøm kan dette føre til problemer. This is solved by the addition of SDS to the protein samples. Dette er løst ved tillegging av SDS til protein vareprøver. SDS binds to proteins every few amino acids and neutralizes the charge differences that proteins have. SDS binder til proteiner noen aminosyrer og neutralizes kostnaden forskjeller at proteiner har. This allows proteins to be separated by size and not by charge. Dette gjør at proteiner skal være atskilt av størrelse og ikke av kostnader.

[ Top ] [Top]

SDS-PAGE Gel Preparation for Western Blot SDS-PAGE Gel Klargjøring for Western Blot

- depending on how much protein you will want to load for western blotting, you should use small combs or larger combs. -- Avhengig av hvor mye protein du ønsker å laste for western blotting, bør du bruke lite Combs eller større Combs.

- the percentage of acrylamide is important. -- Prosentandel av acrylamide er viktig. Usually 10% acrylamide is used. Vanligvis 10% acrylamide brukes.

- A resolving gel is used at the bottom with a pH of 8.8 -- En løse gel brukes på bunnen med en pH på 8,8

- A stacking gel (4-5%) pH 6.8 is used to pack proteins in together after loading -- En stabling gel (4-5%) pH 6,8 er brukt til å pakke proteiner i sammen etter lasting

- Polymerization of gels is increased by the catalysts APS and TEMED which speed up the polymerization reaction (formation and solidification) of the poly-acrylamide gel. -- Polymerization of gels er økt med katalysatorer APS og TEMED som hastighet opp polymerization reaksjon (formasjon og solidification) av polygon-acrylamide gel.

- Load every Sample carefully and slowly to prevent sample leaking out of the lane. -- Sett i hver Sample forsiktig og langsomt for å hindre prøve å lekka ut av leia.

- Load every lane and use sample buffer in each (to prevent differences in ). -- Sett i hvert kjørefelt og bruk sample buffer i hver (for å hindre forskjeller i).

[ Top ] [Top]

Gel Electrophoresis Gel Electrophoresis

1. Centrifuge samples for 10 sec after boiling. Centrifuge vareprøver til 10 sekunder etter at det kokes.
2. Load sample into each lane Sett prøven i hvert kjørefelt
3. Load MW reference Last MW referanse
4. Run gel at 100V (constant voltage) or even better at 40 mA (constant current). Kjør gel på 100V (konstant spenning) eller enda bedre ved 40 mA (konstant strøm). Watch protein marker/ladder or dye front for when to stop gel. Sjekk protein markør / leider eller fargestoff front for når du skal stoppe gel. Constant current gives better and sharper results if you have the time. Konstant strøm gir bedre og skarpere resultater hvis du har tid.

- watch for bubbles between glass and under the gel - this means that it is working -- Se etter bobler mellom glass og under gel - Det betyr at den fungerer

- watch for protein migration (should be going down) - if not you have switched the leads and can lose all your samples! -- Se for protein migrasjon (bør gå ned) - hvis ikke du har slått av fører og kan miste alle prøvene!

- Initially run slowly through the stacking gel (~ 50 Volts), this gives sharper bands. -- I utgangspunktet kjøre sakte gjennom stabling gel (~ 50 Volts), dette gir skarpere band.

- Do not run overnight -- Ikke kjør over natten

- Do not over-heat the gel (this causes the gel to lose rigidity, leading to poor resoloving and blurry badly formed bands) -- Ikke over-varme gel (dette fører til at gel for å miste stivhet, noe som fører til dårlig resoloving og uskarpt dårlig dannet band)

[ Top ] [Top]

Tranfer of Proteins to Membrane for Western Blotting Tranfer av proteiner til Membran for Western Blotting

Select Membrane Type: Velg Membran Type:

Can use either: Kan bruke enten:

- PVDF membrane for western blots -- PVDF membran for western blots

- Nitrocellulose membrane for western blots -- Nitrocellulose membran for western blots

- Nylon membrane (rarely used now - can tear) -- Nylon membran (sjelden brukes nå - kan rive)

Tips for Transfering to Western Membrane: Tips om overføring til Vest Membran:

-Wear Gloves at all times! - Bruk hansker til alle tider! Use forceps Bruk forceps

- Minimize touching/forceps to the membrane -- Minimere berøre / forceps til membran

Bio-RAD transfer order: Bio-RAD overføre bestillingen:

(-)
sponge on black svamp på svart
filter paper filter paper
gel nitrocellulose gel nitrocellulose
filter paper filter paper
sponge svamp
(+)

Transfer : Transfer:

- Keep cool in 4C -- Oppbevar kjølig i 4C

- Transfer overnight at 35 V -- Transfer overnatter på 35 V

- Can transfer quickly in 1 hour at higher V -- Kan overføre raskt i 1 time og høyere V

[ Top ] [Top]

Western Blot Western Blot

Blocking of Membranes allows you to maximize signal:noise ratio Blokkering av membraner gir deg mulighet til å maksimere signal: noise ratio

- wear gloves -- Slitasje hansker

- Block with 5% Blotto (non-fat dry milk - powder) or 1 - 5% BSA (Bovine Serum Albumin) for phosphorylated proteins. -- Blokk med 5% Blotto (ikke-fett tørr melk - pulver) eller 1 til 5% BSA (Bovine albumin) for phosphorylated proteiner.

- Buffer is TBST -- Bufferen er TBST

Washing After Blocking Vaskeråd Etter Blokkering

- washing after blocking steps is not critical, as people often block during primary antibody incubations. -- Vask etter blokkerer fremgangsmåten ikke er kritisk, som folk ofte blokkere under primære antistoffet incubations.

- washing is usually done with TBST buffer. -- Vasking er vanligvis gjøres med TBST buffer. Can be done quickly with a large volume of TBST. Kan gjøres raskt med et stort volum av TBST.

Incubation with Primary Antibody Incubation med Primary Antibody

- mouse, rabbit or other species -- Mus, kanin eller andre arter

- usually 1 : 1000 dilution with TBST -- Vanligvis 1: 1000 fortynning med TBST

- if high background/many non-specific bands is a problem, incubations can be done with 5% BSA or Milk. -- Hvis høy bakgrunn / mange ikke-spesifikke band er et problem, incubations kan gjøres med 5% BSA eller melkeprodukter.

Washing after Primary Antibody Vask etter Primary Antibody

- not so critical -- Ikke så kritisk

- can wash quickly with large volumes of TBST -- Kan vaske raskt med store mengder TBST

Incubation of Secondary Antibody Incubation of Secondary Antibody

- usually diluted 1 : 10, 000 with TBST -- Vanligvis fortynnet 1: 10, 000 med TBST

- anti-mouse, anti-rabbit, or other antibody conjugated with HRP enzyme for detection -- Anti-mus, anti-kanin, eller andre antistoffer conjugated med HRP enzym for gjenkjenning

Washing After Secondary Antibody Vaskeråd Etter Secondary Antibody

- CRITICAL -- Kritisk

- Wash 5 X for 5 minutes with TBST. -- Vask 5 X for 5 minutter med TBST.

- If you really must rush, wash at least 3 times with larger volumes of TBST. -- Hvis du virkelig må Rush, vaske minst 3 ganger med større mengder TBST.

Assaying for Results Assaying for resultater

- usually ECL (Enhanced Chemiluminescence) is used -- Vanligvis ECL (Enhanced Chemiluminescence) brukes

- film is exposed and developed. -- Filmen er utsatt og utviklet. Exposure for 10 seconds is usually enough for total protein. Eksponering for 10 sekunder er vanligvis nok av totalt protein. Phospho-proteins can require 2 - 20 minute exposures. Phospho-proteiner kan kreve 2 - 20 minutters eksponeringer.

- film is usually XOMAT or similar 'fast' film -- Filmen er vanligvis XOMAT eller lignende "rask" film

[ Top ] [Top]

See Troubleshooting Western Blot Se Feilsøking Western Blot

Terms used in western blotting: Vilkår brukes i western blotting:

WB - western blot WB - Western blot

IB - immunoblot (another term for western blotting) IB - immunoblot (et annet uttrykk for western blotting)

SDS - Sodium Dodecyl Sulfate (a detergent used in many western blotting solutions) SDS - Natrium Dodecyl sulfat (et rengjøringsmiddel som brukes i mange western blotting løsninger)

PAGE - Polyacrilamide Gel Electrophoresis -- Polyacrilamide Gel Electrophoresis

Ab - Antibody (antibodies are used to detect your protein of interest) Ab - Antibody (antistoffer brukes til å gjenkjenne dine protein av interesse)

HRP - Horse Radish Peroxidase HRP - Horse reddik Peroxidase

Luminol - substrate that HRP cleaves to cause light formation Luminol - underlaget som HRP cleaves å føre lys formasjon

ECL - Enhanced Chemiluminescence ( western blot solution which enhances light formation from HRP + Luminol) ECL - Forbedret Chemiluminescence (western blot løsning som forbedrer lys formasjon fra HRP + Luminol)

kD/kDa - kilodalton (most proteins average between 30 - 80 kDa) KD / kda - kilodalton (mest proteiner gjennomsnittlig mellom 30 - 80 kda)

RAM - rabbit anti-mouse Ig RAM - kanin anti-Mouse Ig

Ig - Immunoglobulin(an antibody isotype) Ig - Immunoglobulin (et antistoff isotype)

NP-40 - Nonidet P-40 NP-40 - Nonidet P-40

PMSF - phenylmethylsulfonyl fluoride PMSF - phenylmethylsulfonyl fluor

BSA - Bovine Serum Albumin BSA - Bovine albumin

NFDM - Non-fat dry Milk NFDM - Non-fett tørr Milk

[ Top ] [Top]

[ Top ] [Top]