home > protein > troubleshooting-western-blots > index.php home> protein> feilsøking-western-blots> index.php
 |
|---|
The Molecular Station Guide to Western Blotting Problems and Solutions: Common Western Blot Problems and Solutions for them! The Molecular Station Guide to Western Blotting problemer og løsninger: Felles Western Blot problemer og løsninger for dem!
Please Contact Us with your ideas if you can add to this guide. Vennligst kontakt oss med dine ideer om du kan legge til denne håndboken.
Membrane is Glowing in the Dark Room Membran er Glowing in the Dark Room
Spots on Film Kapasitet på film
Too many Bands in Western Blot For mange Bands på Western Blot
Troubleshooting Western Blots Problem: Feilsøking Western Blots Problem:
Spots on Film (missing bands) : Kapasitet på film (mangler band):
- Poor Transfer due to air bubbles during transfer to membrane -- Dårlig overføring på grunn av luft bobler under overføring til membran
- dirty film when adding to the developer -- Dirty film når du legger til utvikleren
- developer rolls are dirty -- Utvikler ruller er skitne
Solution to spots on film: Løsningen til kapasitet på film:
- use a pasteur pipette as a roller. -- Bruk en pasteur pipette som en sylinder. roll the membrane and gel before transfer to remove bubbles. rull membranen og gel før overføringen for å fjerne bobler. keep membrane and materials wet. holde membran og materialer våt.
- keep film clean before adding to the developer -- Hold film rene før du legger til utvikleren
Troubleshooting Western Blots Problem: Feilsøking Western Blots Problem:
Too Many Bands in Western Blot : Too Many Bands på Western Blot:
- usually due to many non-specific bands -- Vanligvis på grunn av mange ikke-spesifikke band
- poor primary antibody quality or old antibody -- Poor Primary Antibody kvalitet eller gamle antistoff
- not enough blocking -- Ikke nok blokkerer
- proteolytic cleavage of antigen - all additional bands are lower MW than your protein, ( ie your protein is being detected but was degraded) -- Proteolytic cleavage av antigen - alle andre band er lavere MW enn protein, (det vil si proteiner blir oppdaget, men ble forringet)
Solutions to too many bands on western blot: Løsninger på for mange band på western blot:
- purchase another antibody or replace with a fresh antibody stock -- Kjøpe et annet antistoff eller erstatte med en frisk antistoffet lager
- block with 5% dry non-fat milk or BSA prior to adding primary. -- Blokk med 5% tørr ikke fett melk eller BSA før du legger primære. If you are already blocking, consider blocking during primary and secondary antibody incubations and also increasing blocking milk or BSA concentration. Hvis du allerede blokkerer, bør du vurdere å blokkere under primær og sekundær antistoff incubations og også øke blokkerer melk eller BSA konsentrasjon.
- keep everything on ice, use fresh samples, store in - 80C, and use protease inhibitors such as PMSF -- Holde alt på isen, bruker ferske eksempler, lagre i - 80C og bruke Protease hemmere som PMSF
Troubleshooting Western Blots Problem: Feilsøking Western Blots Problem:
High background; low signal to noise ratio on Western Blot High bakgrunn; lave signal til støy forholdet på Western Blot
- black or every dark film; film was exposed too long -- Svart eller hver mørk film, film ble utsatt for lang
- blocking was insufficient ; non-specific binding of primary antibody and secondary antibodies were not washed completely -- Blokkerer var utilstrekkelig; ikke-spesifikk binding av antistoffet primære og sekundære antistoffer ikke var vasket helt
- washing was insufficient -- Vasking var utilstrekkelig
- film glows in dark! -- Film lyser i mørket! - too high secondary or primary dilutions -- For høy sekundære eller primære dilutions
Solutions to Dark Film: Løsninger for Dark Film:
- expose for less time, decrease exposure time -- Utsettes for kortere tid, redusere eksponering tid
- increase blocking duration of non-fat dry milk 5% incubation or increase the concentration. -- Økning blokkerer varigheten av ikke-fett tørr melk 5% incubation eller øke konsentrasjonen.
- also you can try blocking with whole serum of the host animal with (or before) the secondary antibody -- Også kan du prøve å blokkere med hele serum av verten dyr med (eller før) den sekundære antistoffet
- increase washing times and volumes to help remove any non-specific signal due to weak antibody binding. -- Økning vaske ganger og volumer for å bidra til å fjerne eventuelle ikke-spesifikke signal på grunn av svak antistoffet bindende.
- using a stronger detergent to wash - Instead of TBST (Tween-20), use stronger detergents such as NP-40 or SDS which may provide a more stringent wash and reduce background (do this only if you band is strong! - washing also removes some your band of interest!) -- Bruke et sterkere vaskemiddel til vask - i stedet for TBST (Tween-20), bruk sterkere vaskemidler som for eksempel NP-40 eller SDS som kan gi en mer strenge vask og redusere bakgrunn (bare gjøre dette hvis du band er sterk! - Vask også fjerner noen bandet ditt av interesse!)
- very high secondary antibody (or even primary) concentration - perform optimization experiments to determine proper antibody dilutions. -- Svært høy sekundære antistoffer (eller primære) konsentrasjon - utføre optimalisering eksperimenter for å fastslå riktig antistoffet dilutions. dilute the antibodies further. utvanne det antistoffer videre.
Troubleshooting Western Blots Problem: Feilsøking Western Blots Problem:
Low Signal or Weak Signal Lav Signal eller Svakt signal
- due to not enough protein loaded on the gel -- På grunn av ikke nok protein lastet på gel
- primary antibody is old or not good -- Primære antistoffet er gamle eller ikke gode
- phospho-proteins usually need overnight primary antibody incubation -- Phospho-protein vanligvis trenger overnatting Primary Antibody incubation
- not enough secondary antibody -- Ikke nok sekundære antistoffet
- over-blocking -- Over-blokkering
- developing reagents are bad / you made a mistake when preparing them -- Utvikle reagenser er dårlig / du har gjort en feil når du forbereder dem
Solutions to Low Signal or Weak Signal : Løsninger for Low Signal eller Svakt signal:
- load more protein sample onto gel -- Load mer protein eksemplar på gel
- try fresh primary antibody -- Prøv ferske Primary Antibody
- incubate primary antibody overnite for phosphoproteins at 4 degrees C (cold room shaker) -- Incubate Primary Antibody overnite for phosphoproteins på 4 grader C (kaldt rom shaker)
- increase concentration of protein (lyse samples in less lysis buffer) -- Øke konsentrasjonen av protein (lyse eksempler på mindre lysis buffer)
- decrease concentration of blocking agent -- Redusere konsentrasjonen av blocking agent
- check the developing reagents; prepare fresh ECL and re-ECL the membrane -- Kontrollere utvikle reagenser; forberede fersk ECL og re-ECL membranen
- increase the concentration or the length of primary antibody incubation period -- Øke konsentrasjonen eller lengden av primære antistoffet incubation period
- increase concentration or the length of secondary antibody incubation period -- Øke konsentrasjonen eller lengden av sekundære antistoffet incubation period
Fuzzy Bands, Bands Smeared, Bands not Sharp Fuzzy Bands, Bands utflytende, Bands ikke Skarp
- bands smeared due to hot gel -- Band utflytende på grunn av varme gel
- bands fuzzy due to high voltage -- Band uklar på grunn av høy spenning
Solutions to Fuzzy bands and Un-sharp Bands: Løsninger for Fuzzy band og FN-skarpe band:
- decrease voltage or current, run in cold room, and prepare new running buffer. -- Redusere spenning eller strøm, kjøre i kalde rom, og forberede ny kjører buffer. ( heat causes the gel to lose its rigidity and its resolving power) (Varme fører til at gel for å miste sin stivhet og løse strøm)
- pre-soak transfer membrane in the appropriate transfer solution (determined by the membrane manufacturer) for the required length of time. -- Pre-suge overføre membran i den aktuelle overføringen løsning (bestemmes av membranen produsenten) for de nødvendige lang tid.
Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | ©2005-2007 Molecular Station.com, All rights reserved. Disclaimer / Terms of Service | Privacy Policy | © 2005-2007 Molecular Station.com, all rights reserved.
Send this page to a friend Send denne siden til en venn
![[أربيك]](http://www.molecularstation.com/translate/images/flag_ar.gif){kind=small}
