Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatikk, protokoller, DNA RNA Protein Proteomikk

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologi Hjem Protokoller Bioinformatic Verktøy Biology Forum Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark oss!

home > protein > protein-protocols > western-blotting > index.php home> protein> protein-protokoller> Western-blotting> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molecular Biology Hjem Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomikk Research BETA! Bioinformatikk laboratorieutstyr Molecular Biology Teknikker Molecular Biology Produkter og tjenester relatert Biology Links

Molecular Biology Blog Molecular Biology Blog

Send this page to a friend Send denne siden til en venn

Intracellular Stations Intracellular Stations

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody Botany Felles Buffer Buffer Alfabetisk Bokbutikk Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis histologi Microarrays Immunology mass spectrometry mikrobiologi Molecular Imaging Peptid Proteomikk Protein microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi og siRNA Stilk Cellen Biology Transfection Western Blot

Western Blot Western Blot

Western Blot Protocols Western Blot Protokoller

Western Blot Forum Western Blot Forum

Western Blot Products Western Blot Produkter

Western Blot Books Western Blot Bøker

Western Blot Troubleshooting Western Blot Feilsøking

Western Blot Books Western Blot Bøker

Western Blotting Protocol Western Blotting Protocol

Western-blot protocol Vest-klatt protokoll

Preparation of Samples for SDS-PAGE Gel Electrophoresis from Prepared Cell Lysates Klargjøring av vareprøver av SDS-PAGE Gel Electrophoresis fra Preparerte Cell Lysates

1. Prepare gels for SDS-PAGE Forbered gels av SDS-PAGE
2. Prepare 1X running buffer Forbered 1X kjører buffer
3. Add 50 mL of beta-mercaptoethanol to 950 ml sample buffer (for 1 mL). Legg til 50 ml av beta-mercaptoethanol til 950 ml prøve buffer (1 ml). (only if you have not pre-added beta-mercaptoethanol to sample buffer) (bare hvis du ikke har fra før lagt til beta-mercaptoethanol å sample buffer)
4. Add sample buffer to each sample (pre-determine how much sample you can load per well - BioRad thin combs can retain about 30uL. Large combs can accomate up to 50uL). Legg til sample buffer for hvert eksemplar (pre-fastslå hvor mye prøven kan du laste per brønn - BioRad tynne Combs kan beholde om 30uL. Large Combs kan accomate opptil 50uL).
5. Vortex samples briefly. Vortex vareprøver kort.
6. Poke a hole in cap of each tube (to prevent the tops popping when boiling) Rote i et hull i korken på hver tube (for å hindre topper spratt når det kokes)
7. Boil in heating block/water bath at (95°C) for 5 minutes (lower temperatures have been shown to prevent non-specific protein aggregation) Koke i oppvarming blokk / vannbad ved (95 ° C) i 5 minutter (lavere temperaturer har vist seg å forhindre ikke-spesifikke proteiner aggregeres)

After Boiling Protein Samples - Loading and Running the SDS-PAGE Gel Etter Koker Protein Vareprøver - Lasting og kjøre SDS-PAGE Gel

1. Centrifuge samples for 1 minute at high speed. Centrifuge vareprøver til 1 minutt i høy hastighet.
2. Load sample into each lane. Sett prøven i hvert kjørefelt.
3. Load MW (molecular weight ladder) reference. Last MW (molecular weight stige) referanse. (you may want (det kan hende du vil
4. Run gel at 100V (100V through stacking gel, voltage can be increased up to 200V when running in separating gel with plenty of running buffer) Kjør gel på 100V (100V gjennom stabling gel, spenning kan økes opp til 200V når du kjører i skille gel med mange kjører buffer)

Transfer of Protein Samples to Membrane Overføring av Protein Prøver å Membran

1. Prepare 1X Transfer buffer Forbered 1X Transfer buffer
2. Soak and shake gel in Transfer buffer for 15 min Sug og riste gel i Transfer buffer på 15 min
3. Soak nitrocellulose membrane (or PVDF) and filter paper (extra thick) for several minutes. Sug nitrocellulose membran (eller PVDF) og filter papir (ekstra tykt) i flere minutter.
4. Place sandwich on transfer cell: Place sandwich på overføring celle:

Extra thick filter paper CLEAR Ekstra tykke filter paper CLEAR
Membrane Membran
Gel
Extra thick filter paper BLACK Ekstra tykke filter paper BLACK

5. Electric transfer: 35V overnite or 90V for 1 hour depending on the size of your protein or your patience! Elektrisk overføring: 35V overnite eller 90 V til 1 time avhengig av størrelsen på protein eller din tålmodighet!

Western Blotting Protocol or Immunoblotting Western Blotting protokollen eller Immunoblotting

1. Prepare 1X TBST from stock solutions. Forbered 1X TBST fra lager løsninger.
2. Prepare blocking buffer (3% Bovine Serum Albumin or 5% Blotting-grade milk (Blotto) in TBST). Forbered blokkerer buffer (3% Bovine albumin eller 5% Blotting-klasse melk (Blotto) i TBST). (you may want to try several different blocking times and conditions). (kan det være lurt å prøve flere forskjellige blokkerer ganger og betingelser).
3. Wash membrane in 1X TBST with shaking for 10 min. Vask membranen i 1X TBST med risting i 10 min.
4. Block at room temperature for 1 hour with blocking buffer (shaking or circular rotator) Blokker i romtemperatur i 1 time med blocking buffer (risting eller sirkulær Rotator)
5. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with primary 1° Ab antibody overnight (for difficult blotting conditions ie phosphorylation of proteins) or 1 hour for ( easy conditions such as total protein) at 4°C (overnite) or room temperature (1 hour incubation only) covered with saran wrap (gentle shaking). Incubate din membran (PVDF eller nitrocellulose) med primær 1 ° Ab antistoffet overnatting (for vanskelig blotting betingelser dvs. phosphorylation av proteiner) eller 1 time for (enkelt forhold som totalt protein) på 4 ° C (overnite) eller romtemperatur (1 time Incubation) dekket med SARAN vikle (svak risting). You can use plastic tubs from the dollar store for this (use these only for blotting!) or use pipette box bottoms. Du kan bruke plast kar fra dollar butikk for denne (bruk disse kun for blotting!) Eller bruke pipette boksen bottoms. The dilution for primary antibody is around 1:1000. Den fortynning av primære antistoffet er rundt 1:1000. See manufacturer's instructions. Se produsentens instruksjoner.
6. Wash with 1X TBST  3 X 15 min Vask med 1X TBST 3 x 15 min
7. Incubate your membrane (PVDF or nitrocellulose) with secondary antibody, 2° Ab for 30 – 45 min or (1 hour - for difficult blotting conditions) at room temperature. Incubate din membran (PVDF eller nitrocellulose) med sekundær antistoff, 2 ° Ab for 30 - 45 min eller (1 time - for vanskelig blotting conditions) ved romtemperatur. The dilution for secondary antibodies is usually 1:10,000 or higher. Den fortynning av sekundære antistoffer er vanligvis 1:10000 eller høyere. (ie 1uL of secondary in 10mL of TBST per membrane) See manufacturer's instructions.  You may want to add your antibody to blocking solution to decrease non-specific binding especially if you got high background in your first experiment. (dvs. 1uL av sekundær i 10mL av TBST med membran) Se produsentens instruksjoner. Du ønsker kanskje å legge til antistoffet til blokkerer løsning for å redusere ikke-spesifikke bindende spesielt hvis du fikk høy bakgrunn i ditt første forsøk.
8. Wash with TBST   4-5 X 10 min. Vask med TBST 4-5 X 10 min. This is the most important washing step. Dette er den viktigste vaske trinn.
9. ECL (5min) ECL (5min)
10. Expose to film. Exposé til filmen. Usually exposure time of western blots is about 10-30 seconds. Vanligvis eksponering tid for western blots er ca 10-30 sekunder. Longer (5-10 minutes) for phosphorylation. Lengre (5-10 minutter) for phosphorylation. If you have a really weak signal, either you need to load more protein or try to increase exposure time (up to 30 minutes - you can try leaving it in a casette longer). Hvis du har et veldig svakt signal, enten du trenger å laste mer protein eller prøve å øke eksponeringen tid (opptil 30 minutter - du kan prøve å forlate den i en kassettspiller lenger).
11. Keep your membrane! Hold membran! You can keep your membrane in TBST 1X in the fridge for a while. Du kan holde membranen i TBST 1X i kjøleskap en stund. You may need it for the following reasons: 1) checking loading (paper reviewers may ask for total protein or a loading standard such as actin). Det kan hende du trenger det av følgende årsaker: 1) sjekke lasting (papir vurderinger kan be om total protein eller lasting standard som actin). Also, you can probe initially for a phospho-protein and then strip and reprobe for total protein. Du kan også undersøke utgangspunktet for en phospho-protein og deretter stripe og reprobe av totalt protein.

Also see our Western Blotting Membrane Stripping Protocol Se også vår Western Blotting Membran Stripping Protocol