Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatikk, protokoller, DNA RNA Protein Proteomikk

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologi Hjem Protokoller Bioinformatic Verktøy Biology Forum Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark oss!

home > protein-microarrays > protein-chip-detection > index.php home> protein-microarrays> protein-chip-gjenkjenning> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molecular Biology Hjem Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomikk Research BETA! Bioinformatikk laboratorieutstyr Molecular Biology Teknikker Molecular Biology Produkter og tjenester relatert Biology Links

Molecular Biology Blog Molecular Biology Blog

Send this page to a friend Send denne siden til en venn

Intracellular Stations Intracellular Stations

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody Botany Felles Buffer Buffer Alfabetisk Bokbutikk Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis histologi Microarrays Immunology mass spectrometry mikrobiologi Molecular Imaging Peptid Proteomikk Protein microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi og siRNA Stilk Cellen Biology Transfection Western Blot

Protein Array Protocols Protein Array Protokoller	Protein Array Bioinformatics Protein Array Bioinformatikk	Learn about Protein Arrays Lær mer om Protein Arrays	Protein Array Kits and Products Protein Array Kits og produkter	Protein Array Forum Protein Array Forum	Proteomic News Proteomic Nyheter

Protein Microarray Detection Methods and Analysis Protein microarray Detection Metoder og analyse

Protein and Antibody Microarrays Protein og Antibody Microarrays

Detection Methods and Analysis for Protein and Antibody Chips Detection Metoder og analyse av Protein og Antibody Chips

Detection Methods and Non-specific Binding Detection Metoder og Non-spesifikk Bindende
Non-specific binding to the array needs to be minimized and this is typically done by immersing the arrays in a bovine serum albumin based buffer (BSA) (31). Non-spesifikk binding til matrisen må minimeres og dette skjer vanligvis ved immersing av matriser i en bovin albumin basert buffer (BSA) (31).
Analyte-binding and retention on protein arrays proceeds via thermodynamically driven binding mechanism similar to the hybridization of nucleic acid targets to probes.  However, the detection of bound targets to proteins is considerably more complex than that of DNA microarray detection (9).  Currently a variety of detection methods are being examined.  For example, ELISA was first used to detect proteins for both filter arrays (66,67) and glass arrays (68). Analyte-bindende og oppbevaring på protein arrays går via thermodynamically drevet bindende mekanisme lik hybridization of nucleic acid mål å probes. Imidlertid gjenkjenning av bundet mål til proteiner er betydelig mer kompleks enn for DNA microarray gjenkjenning (9). Øyeblikket en rekke gjenkjenning metoder blir vurdert. For eksempel, Elisa ble først brukt til å gjenkjenne proteiner for både filter arrays (66,67) og glass arrays (68).  ELISA based detection methods have the disadvantage of non-specificity of protein-antibody interactions, leading to many false positives.   Radioisotope labeling was used by Ge et al. (22), radioisotope labeling to study protein–protein, protein–DNA, protein–drug interactions on filter arrays.  Zhu et al. used radioisotope labeling to conduct kinase assays of different substrates by using purified yeast kinase proteins on a array (36).  The preferred method of detection is fluorescence detection because these methods are generally safe, extremely sensitive, simple and can have very high resolution.  These detection methods are also compatible with standard microarray scanners. Elisa basert gjenkjenning metoder har ulempe av ikke-spesielle ved protein-antistoff samspill, fører til mange falske positiver. Radioisotope merking ble brukt av Ge et al. (22), radioisotope merking for å studere protein-protein, protein-DNA, protein - narkotikarelaterte handlinger på filter arrays. Zhu et al. brukes radioisotope merke til gjennomføring kinase essay av ulike substrates ved hjelp av renset gjær kinase proteiner på en matrise (36). foretrukket metode for påvisning er fluorescens deteksjon fordi disse metodene er generelt trygt, ekstremt sensitiv , Enkel og kan ha svært høy oppløsning. Disse gjenkjenning metoder er også kompatibel med standarden microarray skannere. Generally, a chip is either directly probed with a fluorescent molecule (eg a fluorescently labeled protein or small molecule, by using a tagged probe (eg biotin), which can then be detected in a second step using a fluorescently labeled affinity reagent (eg streptavidin) (16,56). Another fluorescent labeling method is rolling circle amplification (RCA), which is also extremely sensitive (32). Vanligvis en brikke er enten direkte probed med et fluorescerende molekyl (f.eks en fluorescently merket protein eller små molekyler, ved hjelp av en merket probe (f.eks Biotin), som kan bli oppdaget i det andre trinnet ved hjelp av en fluorescently merket tilhørighet reagent (f.eks streptavidin ) (16,56). Another fluorescerende merking metoden er rullende sirkel forsterkersystem (RCA), som også er svært sensitivt (32).
Although the proteomes under comparison can be labeled in a comparable fashion with fluorophores, the reproducibility of these chemical reactions is poor and interference with the protein-antibody interactions presents an additional complexity (9). Selv om proteomes under sammenligning kan være merket på en sammenlignbar måte med fluorophores, Reproduserbarhet av disse kjemiske reaksjoner er dårlig og forstyrrelser med protein-antistoff samhandling presenterer en ekstra kompleksitet (9). Also, non-uniform labeling of proteins can be addressed by performing a dual-colour ratiometric assay, where an internal standard is present for each target protein which is measured (9). Også ikke-enhetlig merking av proteiner kan tas opp ved å utføre en dobbel-farge proporsjonal analysen, der en intern standard er til stede for hver blink protein som er målt (9).          A disadvantage of labeling proteins with fluorophores is a reduction of the quantitative accuracy of the assay, as incorporation of the label may alter the binding properties of the proteins (9). En ulempe med merking proteiner med fluorophores er en reduksjon av den kvantitative nøyaktigheten av analysen, som inkorporering av etiketten kan endre den bindende egenskaper av proteiner (9).

Although direct protein labeling detection methods are still widely used, the intrinsic problems mentioned has resulted in the increasing use of label free detection methods for protein microarrays.  These methods are mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (AFM) (70), and surface plasmon resonance (SPR) (71). Selv om direkte protein merke gjenkjenning metoder er fortsatt mye brukt, indre problemer nevnt har resultert i økende bruk av etiketten gratis gjenkjenning metoder for protein microarrays. Disse metodene er mass spectrometry (MS), atomic force microscopy (Afm) (70), og surface plasmon resonans (SPR) (71).
Non-labeling methods have advantages as a direct detection approach for antibody microarrays since labeling molecules affects protein activity. Non-merking metoder har fordeler som en direkte oppdagelse tilnærming til antistoffet microarrays siden merking molekyler påvirker protein aktivitet. SELDI (surface-enhanced laser desorption/ionization) mass spectrometry has been used to detect low-density arrays of captured proteins (69). SELDI (overflaten forbedret laser desorption / ionization) mass spectrometry har vært brukt til å gjenkjenne low-density arrays av fanget proteiner (69). Proteins are captured on a metal surface array (SELDI protein array) and are vapourized using a laser beam.  Analysis using mass spectrometry data is then performed in order to reveal the identities of these proteins. Proteiner er fanget på en metall overflate array (SELDI protein array) og er vapourized ved hjelp av en laser beam. Analyse ved hjelp mass spectrometry data er deretter utført for å avsløre identiteten til disse proteiner.

Atomic force microscopy (AFM) method uses surface topological changes to identify the captured proteins on an antibody array (70). Atomic force microscopy (Afm) metoden bruker overflaten topologiske endringer for å identifisere fanget proteiner på en antistoffet array (70).  When rabbit IgG is immobilized on a gold surface and binds to its complimentary antibodies, goat ant-rabbit IgG, AFM detects the increase in height, and thus is able to measure binding interactions.  However in order to study the kinetics of antigen–antibody interactions, real-time detection methods will be useful. Når kanin IgG er immobilized på en gull overflate og binder for sin gratis antistoffer, geit Ant-kanin IgG, Afm oppdager økning i høyden, og dermed er i stand til å måle forpliktende samhandling. Men for å studere kinetics av antigen-antistoff samhandling , Real-time detection metoder vil være nyttig.  Surface plasmon resonance (SPR) has matured into a versatile detection tool to study the kinetics of receptor–ligand interactions with a wide range of molecular weights, affinities and binding rates (72-74). Surface plasmon resonans (SPR) har modnet til en allsidig gjenkjennings-verktøyet til å studere kinetics av receptor-ligand interaksjoner med et bredt spekter av molekylære vekt, affinities og bindende priser (72-74). Commercial SPR chips are available however their detection resolution is limited.  A sensor surface with 64 individual immobilization sites in a single flow cell was developed (75).  An antibody array biosensor was also developed to study the kinetics of antigen binding using a planar waveguide as the detection method. Kommersiell SPR sjetonger er tilgjengelig imidlertid sine gjenkjenning oppløsningen er begrenset. Sensor overflate med 64 individuelle immobilization områder i en enkelt celle flyt ble utviklet (75). En antistoffet matrise biosensor ble også utviklet for å studere kinetics av antigen bindende ved hjelp av en planar waveguide som gjenkjennings-metoden. Using this method, the group demonstrated that significant signal intensity could be achieved from spots as small as 200 mm in diameter. Ved hjelp av denne metoden, i gruppen viste at betydelige signal intensitet kunne oppnås fra flekker så liten som 200 mm i diameter. It is therefore expected that this approach will be suitable for high-throughput and parallel kinetics studies. Det er derfor forventet at denne tilnærmingen vil være egnet for høy overføringshastighet og parallelt kinetics studies. (76).

Range of Detection Range of Detection
Another difference between protein and DNA microarrays is that protein concentrations in a single biological sample or cells are several orders of magnitute greater than that for mRNAs.  Thus protein chip detector systems must have a very large range of detection operation – up to a factor of 1014, compared to 104 for mRNA.  Thus an antibody with nanomolar affinity to a particular target will be saturated by the presence of this target at micromolar concentrations and will fail to detect pico- or femtomolar target levels.  Thus accommodating rare and abundant proteins will probably require separate arrays (7,8,9). En annen forskjell mellom protein og DNA microarrays er at protein konsentrasjon i en enkelt biologisk prøve eller celler er flere bestillinger av magnitute større enn det som gjelder for mRNAs. Således protein chip detektor systemer må ha et meget stort utvalg av gjenkjennings-drift - opp til en faktor på 1014 , Sammenlignet med 104 for mRNA. Således en antistoffer med nanomolar tilhørighet til et bestemt mål vil være mettet av tilstedeværelse av dette målet på micromolar konsentrasjoner og vil mislykkes i å gjenkjenne pico-eller femtomolar målet. Således accomodating sjeldne og rikelig med proteiner vil trolig kreve separate arrays (7,8,9).
Multiple antibodies with varying affinities for the target may be positioned at different areas of the array however studies have shown that only 20% of arrayed antibodies provide measurements of proteins at low concentrations (33). Flere antistoffer med varierende affinities til målet kan være plassert på ulike områder av tabellen men studier har vist at bare 20% av grupperte antistoffer gir målinger av proteiner ved lave konsentrasjoner (33).

Next: Protein Production for Protein Arrays Neste: Protein Produksjon av Protein Arrays

References for Protein and Antibody Microarrays Referanser for Protein og Antibody Microarrays

Back to: Tilbake til:

Introduction and Background to Protein Chips and Antibody Chips. Innledning og Bakgrunn for Protein Chips og Antibody Chips.

Types of Antibody and Protein Chips Typer Antibody og Protein Chips