Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

PCR Protocols PCR-protokoller	PCR Bioinformatics and Databases PCR Bioinformatikk og databaser	Learn about PCR Lær om PCR	PCR Kits and Products PCR Kits og produkter	PCR Forum PCR Forum	PCR Books PCR Bøker

Successful PCR Conditions Vellykket PCR Conditions

Parameters for Successful PCR Parametere for vellykkede PCR

Are you having problems of achieving a successful PCR?  Many factors can affect your outcome of your PCR such as: Metal Ion Cofactors, Substrate and Substrate Analogs, Buffers and Salts and Cosolvents.  Also Thermal Cycling Considerations:  PCR Vessels, Temperature and Time Optimization, PCR Amplification Cycles, Enzyme/Target and Hot Start. Er du har problemer med å oppnå en vellykket PCR? Mange faktorer kan påvirke utfallet av PCR som: Metal Ion Cofactors, underlaget og underlaget Analogs, Buffer og salter og Cosolvents. Also Termisk Sykling Vurderinger: PCR Vessels, temperatur og klokkeslett optimalisering PCR Amplification Cycles, Enzym / Mål og Hot Start.

Metal Ion Cofactors and PCR Metal Ion Cofactors og PCR

An essential cofactor for the DNA polymerase in PCR is Magnesium chloride.  Its concentration must be optimized for every primer:template system. En vesentlig cofactor for DNA polymerase i PCR er Magnesiumklorid. Its konsentrasjonen må være optimalisert for hver grunning: template-systemet. Many components of the reaction bind magnesium ion, including primers, template, PCR products and dNTPs. Mange komponenter i reaksjonen bind magnesium ion, inkludert første, mal, PCR-produkter og dNTPs. The main 1:1 binding agent for magnesium ion is the high concentration of dNTPs in the reaction. Hovedformålet 1:1 bindende agent for magnesium ion er den høye konsentrasjonen av dNTPs i reaksjonen. Because it is necessary for free magnesium ion to serve as an enzyme cofactor in PCR, the total magnesium ion concentration must exceed the total dNTP concentration. Fordi det er nødvendig for gratis magnesium ion å tjene som et enzym cofactor i PCR, totalt magnesium ion konsentrasjonen må overstige det totale dNTP konsentrasjon. Typically, to start the optimization process, 1.5 mM magnesium chloride is added to PCR in the presence of 0.8 mM total dNTPs. Vanligvis skal starte optimering, 1,5 mm Magnesiumklorid er lagt til PCR i nærvær av 0,8 mm totale dNTPs. This leaves about 0.7 mM free magnesium for the DNA polymerase. Dette etterlater ca 0,7 mm gratis magnesium for DNA polymerase. In general, magnesium ion should be varied in a concentration series from 1.5–4.0 mM in 0.5 mM steps. I generelle, magnesium ion bør være variert i en konsentrasjon serie fra 1.5-4.0 mm i 0,5 mm trinn.

Substrates and Substrate Analogs for PCR Substrates og underlaget Analogs for PCR

The DNA polymerases incorporate very efficiently dNTPs.  They also can incorporate modified substrates, when they are used as supplemental components in PCR. The DNA polymerases innlemme svært effektivt dNTPs. De kan også inkludere endret substrates, når de brukes som supplerende komponenter i PCR. Examples of substrates used for DNA polymerase are: Digoxigenin-dUTP, biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, and fluorescently labeled dNTPs. Eksempler på substrates brukes til DNA polymerase er: Digoxigenin-dUTP, Biotin-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP og fluorescently merket dNTPs. For conventional PCR, the concentration of dNTPs remains balanced in equimolar ratios, eg, 200 μM each dNTP. For konvensjonell PCR, konsentrasjonen av dNTPs fortsatt balansert i equimolar Nøkkeltall, for eksempel 200 μ m hver dNTP. Also note that, deviations from these standard recommendations may be beneficial in certain amplications. Vær også oppmerksom på at avvik fra disse standard anbefalinger, kan være nyttig i visse amplications. For example, when random mutagenesis of a specific target is desired, unbalanced dNTP concentrations promote a higher degree of misincorporations by the DNA polymerase. For eksempel, når tilfeldig mutagenesis av et bestemt mål er ønsket, ubalanserte dNTP konsentrasjoner fremme en høyere grad av misincorporations av DNA polymerase.

Buffers and Salts for PCR Buffer og salter av PCR

Depending on the DNA polymerase used the optimal PCR buffer concentration, salt concentration, and pH should be picked accordingly to the DNA polymerase. Avhengig av DNA polymerase brukt den optimale PCR buffer konsentrasjon, salt konsentrasjon og pH bør bli hentet i henhold til DNA polymerase. The PCR buffer for Taq DNA polymerase consists of 50 mM KCl and 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, at room temperature. The PCR buffer for Taq DNA polymerase består av 50 mm KCl og 10 mm Tris-HCL, pH 8,3, i romtemperatur. This buffer provides the ionic strength and buffering capacity needed during the reaction. Denne buffer gir ionic styrke og bufring kapasitet som trengs i løpet av reaksjon. It is important to note that the salt concentration affects the Tm of the primer:template duplex, and hence the annealing temperature. Det er viktig å merke seg at salt konsentrasjon påvirker tm av grunning: template dupleks, og derav Annealing temperatur.

Cosolvents

Different PCR Cosolvents are used to increase the yield, efficacy, and specificity of PCR amplifications. Ulike PCR Cosolvents brukes til å øke utbytte, effekt, og spesielle ved PCR presiseringer. These cosolvents can be advantageous in some amplifications, and disadvantageous in other amplifications. Disse cosolvents kan være fordelaktig i noen presiseringer, og ufordelaktig i andre presiseringer. It is impossible to predict which additive will be useful for each primer:template duplex and therefore the cosolvent must be empirically tested for each combination. Det er umulig å forutse hvilke additiv vil være nyttig for hver enkelt først: template duplex og derfor cosolvent må være emperisk testet for hver kombinasjon.

Thermal Cycling Considerations Termisk Sykling Vurderinger

PCR Vessels PCR Vessels

PCR must be performed in vessels that are compatible with low amounts of enzyme and nucleic acids and that have good thermal transfer characteristics. PCR må utføres på fartøy som er kompatible med lave mengder enzym og nucleic syrer og som har gode termiske egenskaper. Usually, polypropylene is used for PCR vessels and conventional, thick-walled microcentrifuge tubes are chosen for many thermal cycler systems. Vanligvis polypropylen brukes til PCR fartøy og konvensjonelle, tykke vegger microcentrifuge rør er valgt for mange thermal cycler. PCR is most often performed at a 10–100 μL reaction scale and requires the prevention of the evaporation/condensation processes in the closed reaction tube during thermal cycling. PCR er oftest utført på en 10-100 μ L reaksjon skala og krever forebygging av fordampning / kondensasjon prosesser i de lukkede reaksjon tube under termisk sykling. A mineral oil overlay or wax layer serves this purpose. En mineral olje overlegg eller voks laget tjener dette formålet. More recently, 0.2-mL thin-walled vessels have been optimized for the PCR process and oil-free thermal cyclers have been designed that use a heated cover over the tubes held within the sample block. Flere nylig, 0.2-ml tynne vegger fartøy har blitt optimalisert for PCR prosess-og olje-fri termisk cyclers har blitt utviklet som bruker oppvarmet dekke over rør holdes innenfor eksemplar blokkere.

Temperature and Cycle Time Optimization Temperatur og Cycle Time Optimization

It is essential that the reaction mixtures reach the denaturation, annealing, and extension temperatures in each thermal cycle. Det er viktig at reaksjonen blandinger nå denaturation, Annealing, og forlengelse temperaturer i hvert termisk syklus. If insufficient hold time is specified at any temperature, the temperature of the sample will not be equilibrated with that of the sample block. Hvis ikke nok hold tid er angitt til enhver temperatur, temperaturen i prøven vil ikke bli equilibrated med at av prøven blokkere. Some thermal cycler designs time the hold interval based on the block temperature, whereas others base the hold time on predicted sample temperature. Noen thermal cycler design gang holde intervallet basert på blokken temperatur, mens andre base HOLD tid på anslås eksemplar temperatur. If a conventional thick-walled tube used in a cycler controlled by block temperature, a 60-s hold time is sufficient for equilibration. Hvis en konvensjonell tykke rør brukes i en cycler kontrolleres ved å blokkere temperatur, en 60-s hold tid er tilstrekkelig for equilibration. Extra time may be recommended at the (72°C) extension step for longer PCR products. Ekstra tid kan anbefales på det (72 ° C) forlengelse trinn for lengre PCR produkter. Using a thin-walled 0.2-mL tube in a cycler controlled by predicted sample temperature, only 15 s is required. Ved hjelp av en tynn vegger 0,2-ml tube i en cycler kontrolleres av anslått eksemplar temperatur, bare 15 r er påkrevd. To use existing protocols or to development protocols for use at multiple laboratories, it is very important to choose hold times according to the cycler design and tube wall thickness. Hvis du vil bruke eksisterende protokoller eller utvikling protokoller for bruk på flere laboratorier, er det svært viktig å velge hold ganger i henhold til cycler design og tube vegg tykkelse.

PCR Amplification Cycle Number PCR Amplification Cycle Antall

The number of PCR amplification cycles should be optimized with respect to the starting concentration of the target DNA. Antall PCR forsterkersystem sykluser bør være optimalisert med hensyn til start konsentrasjon av målet DNA. It is recommended that, from 40– 45 cycles to amplify 50 target molecules, and 25–30 cycles to amplify 3 × 105 molecules to the same concentration. Det anbefales at 40 - 45 sykluser for å forsterke 50 mål molekyler, og 25-30 sykluser for å forsterke 3 × 105 molekyler til den samme konsentrasjonen. This non-proportionality is caused by a so-called plateau effect, in which a decrease in the exponential rate of product accumulation occurs in late stages of a PCR. Denne ikke-forholdsmessighet er forårsaket av en såkalt platå effekt, der en reduksjon i eksponensiell rate av produktet akkumulering skjer i sene stadier av en PCR. This may be caused by degradation of reactants (dNTPs, enzyme); reactant depletion (primers, dNTPs); end-product inhibition (pyrophosphate formation); competition for reactants by non-specific products; or competition for primer binding by reannealing of concentrated (10 nM) product. Dette kan være forårsaket av nedbrytning av reactants (dNTPs, enzym); reactant depletion (første, dNTPs); end-produkt hemming (pyrophosphate formasjon); konkurranse for reactants av ikke-spesifikke produkter, eller konkurranse om først bindende etter reannealing av konsentrert ( 10 nm). It is usually advisable to run the minimum number of cycles needed to see the desired specific product, because unwanted nonspecific products will interfere if the number of cycles is excessive. Det er vanligvis best å kjøre minimum antall sykluser trengs for å se ønsket produkt, fordi uønskede nonspecific produkter vil forstyrre hvis antall sykluser er overdreven.

Enzyme / Target Enzym / Target

In a standard aliquot of Taq DNA polymerase used for a 100-μL reaction, there are about 1010 molecules. I en standard aliquot av Taq DNA polymerase som brukes for en 100 - μ L reaksjon, er det rundt 1010 molekyler. Each PCR sample should be evaluated for the number of target copies it contains or may contain. Hver PCR prøven skal bli vurdert for antall mål kopier den inneholder eller kan inneholde. For example, 1 ng of lambda DNA contains 1.8 × 107 copies. For eksempel 1 av av lambda-DNA inneholder 1,8 × 107 eksemplarer. For low-input copy number PCR, the enzyme becomes limiting and it may be necessary to give the extension process incrementally more time. For lav-input kopiere antall PCR, enzymet blir begrensende, og det kan være nødvendig å gi forlengelse prosessen gradvis mer tid. Thermal cyclers can reliably perform this automatic segment extension procedure in order to maximize PCR yield. Termisk cyclers kan sikkert utføre denne automatiske segmentet forlengelse prosedyre for å maksimere PCR gi.

Hot Start Conditions Hot Start Betingelser

All of the above optimizations also apply to a PCR that is designed, from the beginning, with a hot start method. Alle disse optimaliseringene gjelder også til en PCR som er utviklet fra begynnelsen, med en varm start metode. Often, a hot start can be incorporated successfully into a previously optimized PCR without changing the reaction conditions. Ofte en varm start kan bli innarbeidet lykkes i en tidligere optimalisert PCR uten å endre reaksjon forhold. However, it usually pays to reoptimize after adding a hot start. Men det som regel lønner seg å reoptimize etter å legge en varm start. Optimization is often a balance between producing as much product as possible and overproducing nonspecific, background amplifications. Optimalisering er ofte en balanse mellom å produsere så mye produkt som mulig og overproducing nonspecific, bakgrunn presiseringer. Because hot start greatly reduces background amplifications, the upper restraints are raised on conditions such as enzyme concentration, cycle number, and metal ion cofactor concentration. Fordi varm start i stor grad reduserer bakgrunn presiseringer, øvre begrensninger er oppvokst på forhold som enzym konsentrasjon, sykle, og metall ion cofactor konsentrasjon. Sensitive PCRs that have been highly tuned without a hot start may fail when a hot start is added. Sensitive PCRs som har vært svært innstilt uten en varm start kan mislykkes når en varm start er lagt til. This can be caused by slight delays in early cycles caused by mixing or enzyme activation. Dette kan være forårsaket av en liten forsinkelse i tidlig sykluser forårsaket ved å blande eller enzym-aktivering. The PCR usually can be restored, often with substantial increase in specific product, by simply increasing limiting parameters or reagents. The PCR vanligvis kan bli gjenopprettet, ofte med betydelig økning i spesifikt produkt, ved ganske enkelt å øke begrense parametere eller reagenser. In addition, there are optimizations specific to each hot start method. I tillegg er det optimaliseringer spesifikke for hvert varm start metode. Mixing or enzyme activation can be affected by PCR volume, buffer composition and pH, cosolvents, cycling conditions, and so on. Miksing eller enzym-aktivering kan bli påvirket av PCR volum, buffer sammensetning og pH, cosolvents, sykling forhold, og så videre. The specific product’s literature, often a product insert, should be consulted for information on these considerations. Den konkrete produkt-og ungdomslitteratur, ofte et produkt setter inn, bør konsulteres for informasjon på disse hensyn.