Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Recombinant Protein Expression Rekombinante Protein Expression

Copyright © Molecular Station 2006 Copyright © Molecular Station 2006

When you want to characterise a gene or protein of interest, you must first study its function. Når du ønsker å beskrive en genet eller proteinet av interesse, må du først studere dens funksjon. In this molecular era, obtaining a cDNA of your gene of interest is not difficult. I denne molekylære æra, få cDNA av genet av interesse er ikke vanskelig.

To express the cDNA as a protein, ie. For å uttrykke cDNA som et protein, dvs.. a recombinant protein, one can then easily perform functional studies using the recombinant purified protein. en rekombinant protein, kan man enkelt utføre funksjonelle studier ved hjelp av rekombinante renset protein.

Once you have a purified protein you can conduct: Når du har renset protein du kan utføre:

• Protein-protein Interaction Experiments Protein-protein interaksjon Experiments
• Enzyme Kinetics Enzym Kinetics
• Functional Studies of the Protein Funksjonell studier av Protein
• Structural Studies - including protein crystallization, protein structure and NMR. Structural Studies - inkludert protein crystallization, protein struktur og NMR.
• You can also use the protein to make antibodies for further experiments. Du kan også bruke protein til å gjøre antistoffer for videre eksperimenter.

There are two main systems for the expression of recombinant protein. Det finnes to hovedtyper systemer for formidling av rekombinante proteiner. Once you get your cDNA cloned, you must decide where you want to amplify your protein. Når du får din cDNA klon, må du bestemme hvor du vil forsterke din protein. This will be either a prokaryotic (bacterial) or eukaryotic (usually yeast or mammalian cell) system. Dette vil være enten en prokaryotic (bakteriell) eller eukaryote (vanligvis gjær eller mammalian cell). The choice of your system will decide which vector you will need to clone your cDNA into as there are different promoters which function in E.Coli and others that work best with yeast or mammalian systems. Valget av systemet vil bestemme hvilke vektoren må du klone cDNA ditt inn som det finnes ulike arrangører som funksjon i E. coli og andre som fungerer best med gjær eller mammalian systemer.

So which protein expression system will you use? Så som protein expression system vil du bruke?

Systems for Protein Expression Systemer for Protein Expression

Prokaryotic Protein Expression Systems Prokaryotic Protein Expression Systems

Prokaryotic recombinant protein expression systems have several advantages. Prokaryotic rekombinant protein expression systemer har flere fordeler. These include ease of culture, and very rapid cell growth meaning you won't have to wait long to get protein from bacterial systems once you clone your cDNA. Disse omfatter enkle kultur, og veldig rask celle vekst betyr at du ikke trenger å vente lenge for å få protein fra bakteriell systemer når du klone din cDNA. Expression can be induced easily in bacterial protein expression systems using IPTG. Expression kan induserte enkelt i bakterielle proteiner uttrykk systemer ved hjelp av IPTG. Also, purification is quite simple in prokaryotic expression systems and there are a plethora of commercial kits available for recombinant protein expression. Also, rensing er ganske enkel i prokaryotic uttrykk og det er en mengde kommersielle kits tilgjengelig for rekombinant protein expression.

On the other hand, if you need to use your proteins for functional or enzymatic studies prokaryotic systems are a problem as most proteins become insoluble in inclusion bodies and are very difficult to recover as functional proteins. På den annen side, hvis du trenger å bruke proteiner for funksjonell eller enzymatisk studier prokaryotic systemer er et problem som de fleste proteiner blir uløselig i inkludering organer og er svært vanskelig å gjenopprette som funksjonelle proteiner. Furthermore, most if not all post-translational modifications are not added by bacteria and therefore your protein of interest may not be functional. Videre er de fleste om ikke alle post-translational modifikasjoner er ikke lagt inn av bakterier og derfor dine protein av interesse, kan ikke være funksjonelle. Enzymatic studies thus may be unfruitful. Enzymatisk studier og dermed kan være unfruitful.

Eukaryotic Expression Systems Eukaryote Expression Systems

Eukaryotic genes are not really “at home” in prokaryotic cells, even when they are expressed under the control of the prokaryotic vectors.  One reason is that E. coli cells frequently recognize the protein products of cloned eukaryotic genes as outsiders and destroy them.  Another is that prokaryotes do not carry out the same kinds of posttranslational modification as eukaryotes do.  For example, a protein that would ordinarily be coupled to sugars in a eukaryotic cell will be expressed as a bare protein when cloned in bacteria.  This can effect a protein’s activity or stability, or at least its response to antibodies.  A more serious problem is that the interior of a bacterial cell is not as conducive to proper folding of eukaryotic proteins as the interior of a eukaryotic cell.  Frequently, the result is improperly folded, inactive products of cloned genes. Eukaryote gener er egentlig ikke "hjemme" i prokaryotic celler, selv når de er uttrykt under kontroll av prokaryotic vektorer. Én grunn er at E. coli cellene ofte gjenkjenner proteiner produkter av klon eukaryote gener som utenforstående og ødelegge dem. Another er at prokaryotes ikke utføre de samme typer posttranslational modifikasjon som eukaryotes gjøre. For eksempel, et protein som vil vanligvis være koplet til sukker i en eukaryote celle vil bli uttrykt som en bare protein når klones i bakterier. Dette kan faktisk en protein S aktivitet eller stabilitet, eller i det minste sitt svar på antistoffer. En mer alvorlig problem er at det indre av en bakteriell celle er ikke som bidrar til riktig folding av eukaryote proteiner som interiøret i en eukaryote celle. Ofte resultatet er feil foldet, inaktive produkter av klon gener.

Eukaryotic systems for the expression of protein include: Eukaryote systemer for uttrykk av proteiner inkluderer:

• yeast gjær
• mammalian cells mammalian celler
• baculovirus cells (insect) baculovirus celler (insekt)

All these systems are great eukaryotic systems for the expression of recombinant proteins. Alle disse systemene er stor eukaryote systemer for formidling av rekombinante proteiner.
Advantages of eukaryotic protein expression systems include the fact that you can get very high levels of expression. Fordeler med eukaryote protein expression systemer inkluderer det faktum at du kan få svært høye nivåer av uttrykket. The proteins are easy to purify using special tags which are included into the vectors including His, Myc and other tags. Den proteiner er lett å rense ved å bruke spesielle koder som er inkludert i vektorer, inkludert hans, Myc og andre koder.

You can even purchase plasmids which secrete your protein into the media. Du kan også kjøpe plasmids som skjule din protein i media. Therefore you can keep growing your system and collecting the media without lysing your cells. Derfor kan du holde voksende systemet og innkreving av media uten Lysing dine celler. There are no inclusion bodies to worry about and your proteins have intact post-translational modifications. Det er ingen inkludering organer å bekymre seg for og proteiner har intakte post-translational modifikasjoner. These are vital if you are studying the function of a protein and/or protein-protein interactions. Dette er viktig hvis du skal studere funksjon av et protein og / eller protein-protein interaksjoner.

The disadvantages of eukaryotic protein expression systems include the fact that eukaryotic cells do grow slower than prokaryotic cells. Ulempene ved eukaryote protein expression systemer inkluderer det faktum at eukaryote celler kan vokse langsommere enn prokaryotic celler.

Expression Vectors with Strong Promoters Expression Sannsynlighetsregning med sterke Arrangører

The main function of an expression vector is to yield the product of a gene- usually, the more product the better.  Therefore, expression vectors are ordinarily equipped with very strong promoters; the rationale is that the more mRNA that is produced, the more protein product will be made. Hovedfunksjonen til et uttrykk vektorgrafikk er å gi produktet av en gene-regel, mer jo bedre. Derfor uttrykk vektorer er vanligvis utstyrt med meget sterk arrangører; begrunnelsen er at jo mer mRNA som er produsert, jo mer protein Produktet vil bli gjort.
One such strong promoter is the trp (tryptophan operon) promoter.  It forms the basis for several expression vectors, including ptrpL1.  It has a trp promoter/operator region, followed by a ribosome binding site, and can be used directly as an expression vector by inserting a foreign gene into the ClaI site. En slik sterk eksponent er trp (tryptophan operon) arrangøren. Det danner grunnlaget for flere uttrykk vektorer, inkludert ptrpL1. Det har en trp arrangøren / operatør regionen, etterfulgt av en Ribosom bindende området, og kan brukes direkte som et uttrykk vektoren ved å sette inn en utenlandsk genet i ClaI området. Alternatively, the trp control region can be made “portable” by cutting it out with ClaI and HindIII and inserting it in front of a gene to be expressed in another vector Alternativt, trp kontroll regionen kan bli gjort "bærbare" ved å kutte den ut med ClaI og HindIII og sette den foran en genet skal uttrykkes i en annen vektor

Inducible Expression Vectors Inducible Expression Vektorer

It is usually advantageous to keep a cloned gene represed until we are ready to express it.  One reason is that eukaryotic proteins produced in large quantities in bacteria can be toxic.  Even if these proteins are not actually toxic, they can build up to auch great levels that they interfere with bacterial growth.  In either case, if the cloned gene were allowed to remain turned on constantly, the bacteria bearing the gene would never grow to a great enough concentration to produce meaningful quantities of protein product.  The solution is to keep the cloned gene turned off by placing it downstream of an inducible promoter that can be turned off. Det er vanligvis en fordel å beholde en klon genet represed før vi er klare til å uttrykke det. Én grunn er at eukaryote proteiner produsert i store mengder i bakterier kan være giftig. Selv om disse proteiner faktisk ikke giftig, de kan bygge opp til auch stor nivåer som de forstyrre med bakteriell vekst. I begge tilfeller, hvis klon genet ble tillatt å forbli slått på hele tiden, bakterier bærer genet aldri ville vokse til en stor nok konsentrasjon til å produsere meningsfulle mengder protein produkt. Løsningen er å holde de klones genet slås av ved å plassere den nedstrøms en inducible arrangøren som kan være slått av.
The lac promoter is inducible to a certain extent, presumably remaining off until stimulated by the synthetic inducer isopropylthiogalactoside (IPTG).  However, the repression caused by the lac repressor is incomplete, and some expression of the cloned gene will be observed even in the absence of inducer.  One way around this problem is to express our gene in a plasmid or phagemid that carries its own lacI gene, as pBS does.  The excess repressor produced by such a vector keeps our cloned gene turned off until we are ready to induce it with IPTG. The lac arrangøren er inducible til en viss grad, trolig for resten av inntil stimulert av syntetiske inducer isopropylthiogalactoside (IPTG). Men, undertrykkelse forårsaket av lac repressor er ufullstendig, og enkelte uttrykk av genet klones vil bli observert selv i fravær av inducer. En vei rundt dette problemet er å uttrykke vår genet i et plasmid eller phagemid som bærer sin egen lacI genet, som PBS gjør. overkant repressor produsert av en slik vektor holder våre klon genet slås av før vi er klare til å overtale den med IPTG.
Another strategy is to use a tightly controlled promoter as the λ phage promoter PL. En annen strategi er å bruke en tett kontrollert arrangøren som λ Phage arrangøren PL. Expression vectors with this promoter/operator system are cloned into host cells bearing a temperature-sensitive λ repressor gene (c1857).  As long as we keep the temperature of these cells relatively low (32°C ), the repressor functions, and no expression takes place.  However, when we raise the temperature to the nonpermissive level (42ºC), the temperature-sensitive repressor can no longer function and the cloned gene is induced. Expression vektorer med denne arrangøren / operatør system er klones i vert cellene bærer en temperatur-sensitiv λ repressor genet (c1857). Så lenge vi holder temperaturen i disse cellene relativt lav (32 ° C), repressor funksjoner, og ikke uttrykk finner sted. Men når vi øker temperaturen til nonpermissive nivå (42 º C), temperatur-sensitive repressor kan ikke lenger fungerer og klones genet er induserte.

Expression Vectors that Produce Fusion Proteins Expression Vektorar som produserer Fusion proteiner

When most expression vectors operate, they produce fusion proteins.  This might at first seem a disadvantage because the natural product of the inserted gene is not made.  However, the extra amino acids on the fusion protein can be a great help in purifying the protein product. Når de fleste uttrykk vektorer operere, de produserer proteiner fusjon. Dette kan ved første inntrykk en ulempe, fordi det naturlig produkt av det innsatte genet ikke er gjort. Imidlertid den ekstra aminosyrer på fusion protein kan være en stor hjelp i Rengjørende proteinkomponenter produkt .

Consider the oligo-histidine expression vectors, one of which has the trade name pTrcHis.  These have a short sequence just upstream of the multiple cloning site that encodes a stretch of six histidines.  Thus, a protein expressed in such a vector will be a fusion protein with six histidines at its amino end.  Why would we want to attach six histidines to our protein?  Oligo-histidine regions like this have a high affinity for metals like nickel, so we can purify proteins that have such regions using nickel affinity chromatography.  The beauty of this method is its simplicity and speed.  After the bacteria have made the fusion protein, we simply lyse them, add the srude bacterial extract to a nickel affinity column, wash out all unbound proteins, then release the fusion protein with histidine or a histidine analog called imidazole.  This procedure allows us to harvest essentially pure fusion in only one step.  This is possible because very few if any natural proteins have oligo-histidine regions, so our fusion protein is essentially the only one that binds to the column. Vurder oligo-histidine uttrykk vektorer, en som har varenavn pTrcHis. Disse har en kort sekvens rett oppstrøms av flere kloning område som koder en strekning på seks histidines. Således et protein uttrykkes på en slik vektor vil være en fusjon protein med seks histidines på sin amino enden. Hvorfor ville vi ønsker å knytte seks histidines til våre protein? Oligo-histidine områder som dette har en høy tilhørighet til metaller som nikkel, slik at vi kan rense proteiner som har slike områder ved hjelp av nikkel tilhørighet chromatography. Det fine med denne metoden er dens enkelhet og hastighet. Når bakterier har gjort fusion protein, vi bare lyse dem, legge til srude bakteriell pakke til en nikkel tilhørighet kolonnen, vaske ut all ubundet proteiner, og deretter slippe fusion protein med histidine eller en histidine analoge kalt imidazole. Denne fremgangsmåten gjør det mulig for oss å høste hovedsak ren fusjon i bare ett trinn. Dette er mulig fordi svært få om noen naturlige proteiner har oligo-histidine regioner, slik at våre fusion protein er egentlig det eneste som binder til kolonnen .

What if we want our protein free of the oligo-histidine tag? Hva hvis vi ønsker at våre protein gratis av oligo-histidine koden?

The designers of these vectors have thoughtfully provided a way to remove it.  Just before the multiple cloning site, there is a coding region for a stretch of amino acids recognized by the proteolytic enzyme enterokinase.  So we can use enterokinase to cleave the fusion protein into two parts:  the oligo-histidine tag and the protein we want. Designerne av disse vektorer har komme forutsatt en måte å fjerne den. Like før flere kloning området, er det en koding regionen for en strekning av aminosyrer som anerkjennes av proteolytic enzymet enterokinase. Så vi kan bruke enterokinase til Cleave til fusjon protein i to deler: oligo-histidine koden og protein vi ønsker. The site recognized by enterokinase is very rare, and the chance that it exists in our protein is insignificant.  Thus, our protein should not be chopped up as we are removing its oligo-histidine tag.  If we want, we can run the enterokinase-cleaved protein through the nickel column once more to separate the oligo-hisitidine fragments from the protein of interest. Området gjenkjent av enterokinase er svært sjeldne, og sjansen for at den finnes i protein er ubetydelig. Således våre protein bør ikke være hakket opp som fjerner vi den oligo-histidine koden. Hvis vi ønsker, kan vi kjøre enterokinase - cleaved protein gjennom nikkel kolonne enda en gang å skille oligo-hisitidine fragmenter fra protein av interesse.

λ phages have also served as the basis for expression vectors;  one designed specifically for this purpose is λgt11.  This phage contains a lac control region followed by the lacZ gene.  The cloning sites are located within the lacZ gene, so products of a gene inserted into this vector will be fusion proteins with a leader of B-galactosidase. λ phages har også fungert som grunnlag for uttrykk vektorer, en spesielt utviklet for dette formålet er λ gt11. Phage inneholder en lac kontroll regionen etterfulgt av lacZ-genet. kloning områder ligger innenfor lacZ-genet, slik at produkter av en genet innsatt i denne vektoren vil være fusjon proteiner med en leder av B-galactosidase.
The expression vector λgt11 has become a popular vehicle for making and screening cDNA libraries.  λgt11 allows us to screen a group of clones directly for the expression of the right protein.  The main ingredients required for this procedure are cDNA library in λgt11 and an antiserum directed against the protein of interest. Uttrykket vektoren λ gt11 har blitt et populært redskap for å lage og screening cDNA biblioteker. Λ gt11 tillater oss å sortere en gruppe av kloner direkte til uttrykk i høyre protein. Viktigste ingredienser som kreves for denne prosedyren er cDNA bibliotek på λ gt11 og ett antiserum rettet mot protein av interesse.
We plate our λ phages with various cDNA inserts and blot the proteins released by each clone onto a support such as nitrocellulose.  Once we have transferred the proteins from each plaque to nitrocellulose, we probe with our antiserum.  Next, we look for antibody bound to protein from a particular plaque, using labeled protein A from Staphylococcus aureus.  This protein binds tightly to antibody and labels the corresponding spot on the nitrocellulose.  We detect this label by autoradiography or by phosphorimaging, then go to our master plate and pick the corresponding plaque.  Note that we are detecting a fusion protein, not the protein of interest itself.  Furthermore, it does not matter if we have cloned a whole cDNA or not.  Our antiserum is a mixture of antibodies that will react with several different parts of our protein, so even a partial gene will do, as long as its coding region is cloned in the same orientation and reading frame as the B-galactosidase coding region. Vi plate våre λ phages med forskjellige cDNA innsettinger og blot på proteiner gitt ut av hver klone på en støtte som nitrocellulose. Når vi har overført de proteiner fra hver plakett for nitrocellulose, vi sondere med antiserum. Neste vi ser etter antistoffer bundet til protein fra en bestemt plakett ved hjelp merket protein B fra Staphylococcus aureus. protein binder tett til antistoffet og etiketter tilsvarende punkt på nitrocellulose. Vi gjenkjenner denne etiketten ved autoradiography eller ved å phosphorimaging, og deretter gå til vår master plate og velg den tilhørende plakett . Oppmerksom på at vi oppdager en fusjon protein, ikke protein av interesse i seg selv. Videre, det spiller ingen rolle om vi har klones en hel cDNA eller ikke. Vår antiserum er en blanding av antistoffer som reagerer med flere ulike deler av våre protein , Slik at selv en delvis genet vil gjøre, så lenge den koding regionen er klones i samme retning og lesing ramme som B-galactosidase koding regionen.

For a quick recombinant protein expression review see: For en rask rekombinant protein expression vurdering se:

Recombinant Protein Systems Rekombinante Protein Systems

Copyright © Molecular Station 2006 Copyright © Molecular Station 2006