Welcome to Molecular Station! Velkommen til Molecular Station!

You have to register before you can post on our forums or use our advanced features. Du må registrere deg før du kan poste på vårt forum eller bruke vår avanserte funksjoner. Register Now! Registrer deg nå! Its Free and Fast! Its Gratis og rask!

Already registered? Allerede registrert? Login now below. Logg inn nå nedenfor.

User Name: User Name:

Password: Passord:

Remember Me? Husk meg?

Already registered and Forgot your password? Allerede registrert og Glemt passord? Click below to recover it. Klikk nedenfor for å gjenopprette den.

Recover Lost Password Recover Lost Password

Join now - it's fast and free! Bli medlem nå - det er raskt og gratis!

Molecular Station is THE largest network of researchers, scientists and science lovers anywhere! Molecular Station er den største nettverk av forskere, vitenskapsmenn og vitenskap elskere overalt!

Recent Forum Posts Recent Forum Posts

Mass Spectrometry Mass spectrometry

What is a Mass Spectrometer? Hva er en mass spectrometer?

A mass spectrometer is based on the simple fact that different chemicals have different masses, and this is what determines what chemicals are present in a sample. A mass spectrometer er basert på det enkle faktum at ulike kjemikalier har forskjellige masser, og dette er hva som bestemmer hvilke kjemikalier som finnes i et eksemplar. There are many types of mass spectrometers that not only analyze the ions differently but produce different types of ions; however they all use electric and magnetic fields to change the path of ions in some way. Det finnes mange typer mass spectrometers som ikke bare analyserer ionet annerledes, men produserer ulike typer ionet, men de bruker elektriske og magnetiske felt for å endre banen til ionet på noen måte.

During the late 1980s and early 1990s, two new methods of sample ionization caused mass spectrometry to undergo a revolution in biopolymer analysis, namely ESI 38 and MALDI.39 Just over a decade ago, for the first time, mass spectrometric techniques that could measure the molecular masses of femtomole quantities of proteins in excess of 100 kDa, often to better than 0.01% accuracy, became widely available to protein chemists. I slutten av 1980-tallet og tidlig på 1990-tallet, to nye metoder for å prøve forårsaket ionization mass spectrometry å gjennomgå en revolusjon i biopolymer analyse, nemlig ESI 38 og MALDI.39 Litt over et tiår siden, for første gang, masse spektrofotometrisk teknikker som kan måle molecular masser av femtomole mengder proteiner i overkant av 100 kda, ofte bedre enn 0,01% nøyaktighet, ble tilgjengelig for protein apotek. These methods are both successful in forming ions from large, labile biomolecules without significant degradation of the analyte. Disse metodene er både vellykket i forming ionet fra store, labile biomolecules uten betydelig nedbrytning av analyte. Not only are they both sensitive techniques but also speedy – both MS and MS/MS sequence spectra can be acquired within seconds. Ikke bare er de både sensitive teknikker, men også rask - både MS og MS / MS-sekvens Spectra kan bli anskaffet i løpet av sekunder. ESI and MALDI, due to their many differences, are complementary and many biopolymer laboratories have access to both techniques. ESI og MALDI, på grunn av sine mange forskjeller, er komplementære og mange biopolymer laboratorier har tilgang til både teknikker.

Sample preparation: 2-Dimensional Electrophoresis and Mass Spectrometry Eksempel på forberedelse: 2-Dimensional Electrophoresis og mass spectrometry

Sample separation, isolation and preparation for the mass spectrometric techniques generally, involves 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), a technique that can separate as many as 5000 different proteins in a single experiment. Eksempel på separasjon, isolasjon og forberedelse til massen spektrofotometrisk teknikk generelt, innebærer 2-DE (2-Dimenisional Electrophoresis), en teknikk som kan skille så mange som 5000 ulike proteiner i ett enkelt eksperiment. In general, 2-DE is capable of separating proteins within an isoelectric point (pI) range of 3.5–10 and of molecular masses ranging from 6 to 300 kDa, as well as being able to distinguish between post-translationally modified proteins (eg phosphorylated) and their non-modified companions. I generelle, 2-DE er i stand til å skille proteiner innen en isoelectric point (PI) utvalg av 3.5-10 og molekylær massene alt 6 - 300 kda, så vel som å være i stand til å skille mellom post-translationally endret proteiner (f.eks phosphorylated ) Og deres ikke-endret kompanjonger. Once separated, the protein components are revealed by staining techniques (eg silver stain, fluorescent stain, Coomassie blue) and once located they can then be extracted from the gel. Når atskilt, protein komponentene er avslørt av flekker teknikker (f.eks sølv skam, fluorescerende skam, Coomassie blå) og en gang ligger de kan da bli hentet fra gel. Proteins cannot easily be eluted from gels without the use of detergents, which are detrimental to the mass spectrometric analysis; additionally, large proteins tend to be heterogeneous (eg as a result of glycosylation) and so possesses no single molecular mass which can be related to the corresponding entry in a database. Proteiner ikke kan enkelt bli eluted fra gels uten bruk av vaskemidler, som er skadelig for massen spektrofotometrisk analyse; tillegg store proteiner har en tendens til å bli heterogene (for eksempel som følge av glycosylation) og så har ingen enkelt molekylære massen som kan være relatert til tilsvarende oppføring i en database. To overcome these obstacles, the elution step tends to be accomplished after the protein has been digested by an aqueous acetonitrile wash of an excised gel piece. For å overvinne disse hindringene, elution trinn har en tendens til å bli fullført etter at proteiner har blitt fordøyd av en vannholdig acetonitrile vask av en excised gel brikke. This increases the yield of extraction 5 and by using an in-gel digestion method employing trypsin, which has been described and is widely used as published or with minor modifications, produces a MS-compatible sample from which a protein identification can be made. Dette øker utbytte av utvinning 5 og ved hjelp av en in-gel fordøyelse metode å bruke trypsin, som har blitt beskrevet og er mye brukt som utgitt eller med mindre modifikasjoner, produserer et MS-kompatibel eksemplar som en protein identifikasjon kan gjøres. The digestion step can be preceded by an optional reduction and alkylation step to cleave and block disulfide bridges that exist between cysteine residues. Den fordøyelse trinn kan ha en valgfri reduksjon og alkylation trinn for Cleave og blokkere disulfide broer som eksisterer mellom cysteine rester. Robotic systems have been developed to automate the excision of protein spots from the 2D-gel, to carry out the subsequent enzymatic digestion and to transfer the samples onto MALDI-MS target plates for the initial MS analysis. Robotic systemer har blitt utviklet for å automatisere excision of protein spots fra 2D-gel, for å gjennomføre den påfølgende enzymatisk fordøyelse og for å overføre prøvene på MALDI-MS-målet plater for den første MS analyse. For many applications, the peptides recovered from in-gel digestions require concentration and purification before being analysed by mass spectrometry especially if ESI is the ionization method used. For mange programmer, peptides utvinnes fra i-gel digestions krever konsentrasjon og rensing før de blir analysert av mass spectrometry spesielt hvis ESI er ionization metoden brukes. Reversed phase high performance liquid Reversert fase med høy ytelse væske
chromatography (HPLC) is one method of achieving this; another method involves the use of ZipTips (Millipore) (pipette tips packed with C18 material) or Poros R2 perfusion material (Perseptive Biosystems). chromatography (HPLC) er en metode for å oppnå dette, en annen metode innebærer bruk av ZipTips (Millipore) (pipette tips fullpakket med c18 materiale) eller Poros R2 perfusion materiale (Perseptive Biosystems). Despite its widespread acceptance, the limitations of 2-DE include the exclusion of very small or very large proteins, very acidic or very basic proteins, as well as hydrophobic proteins such as membrane proteins. Til tross for sin omfattende aksept, begrensningene av 2-DE inkluderer utestenging av svært små eller svært store proteiner, svært syrlig eller svært grunnleggende proteiner, så vel som hydrophobic proteiner som membran proteiner. It is thought that Det er tenkt at
only 20% of the gel-loaded proteins can be visualised and analysed. bare 20% av gel-loaded proteiner kan være visualised og analysert. Other constraints are that the amount of sample that can be loaded is limited causing the non-observance of Andre begrensninger er at beløpet på sample som kan lastes inn er begrenset forårsaker ikke-overholdelse av
low concentration proteins and also that the most commonly used staining techniques have non-linear response factors. lav konsentrasjon av proteiner og også at de mest brukte flekker teknikker har ikke-lineær respons faktorer. In practice, 2-DE is a labour intensive process involving manual handling steps that offer the opportunity for impurities such as keratin to contaminate the samples. I praksis, 2-DE er en arbeids-intensiv prosess som involverer håndtering av fremgangsmåten som gir mulighet for Impurities som keratin å forurense prøvene. One 2-D gel will take a day to complete and about one month for a complete structural analysis by MS, although automation can help both the contamination problem and speed up the analysis to some extent. En 2-D gel vil ta en dag for å fullføre og om lag én måned for en fullstendig strukturell analyse av MS, selv om automatisering kan hjelpe både forurensning problemet og øke hastigheten på analysen til en viss grad.

Alternative protein separation techniques Alternativ protein separation teknikker

Alternative, MS-compatible methods of protein preparation are under development but no one technology has emerged as a universal replacement. Alternativ MS-kompatible metoder for protein forberedelse er under utvikling, men ikke en teknologi har dukket opp som en universell erstatning. These methods aim generally to interface the protein sample directly to MS/MS analyses thereby eliminating time-consuming sample preparation steps and the need for a preliminary MS analysis. Disse metodene tar sikte på generelt å grensesnittet proteinkomponenter eksemplar direkte til MS / MS analyser og dermed eliminere tidkrevende eksemplar forberedelse trinn og behovet for en foreløpig MS analyse. Capillary isoelectric focusing (CIEF)-MS and preparative isoelectric focusing followed by size exclusion chromatography-MS are methods that have been compared in depth with 2-DE in terms of separation effciency, peak capacity, precision and robustness, with the former appearing the more favourable alternative.The direct analysis of complex peptide mixtures from a mixture of proteins using on-line, reversed phase high performance liquid chromatography (HPLC)-MS/MS has been used successfully as an alternative to 2DE and this has led onto multidimensional chromatography if greater peptide separation is desirable prior to the MS/MS analyses. Capillary isoelectric fokus (CIEF)-MS og preparative isoelectric fokus etterfulgt av størrelsen exclusion chromatography-MS er metoder som har blitt sammenlignet i dybden med 2-DE når det gjelder utskilling effciency, peak kapasitet, presisjon og robusthet, med de tidligere vises det mer gunstig alternative.The direkte analyse av komplekse Peptid blandinger av en blanding av proteiner ved hjelp av on-line, reversert fase væskekromatografi (HPLC) -MS/MS har vært brukt med hell som et alternativ til 2DE og dette har ført til flerdimensjonale chromatography hvis større Peptid separasjon er ønskelig før MS / MS analyser. Examples of two dimensional chromatography include anion or cation exchange followed by reversed phase HPLC and size exclusion chromatography followed by reversed phase HPLC. Eksempler på todimensjonale chromatography inkludere Anion eller cation exchange etterfulgt av reversert fase HPLC og størrelse utestenging chromatography etterfulgt av reversert fase HPLC. Another, alternative approach has been to use combined solid-phase micro-extraction together with capillary electrophoresis(CE) coupled to ESI MS/MS for the analysis of a total protein tryptic digest. En annen, alternativ tilnærming har vært å bruke kombinert solid-phase micro-utvinning sammen med capillary electrophoresis (CE) koplet til ESI MS / MS for analyse av en total protein Trypton fordøye. This method afforded high resolution separation of the peptide fragments allowing the identification of 80–90% of the proteins in this particular yeast ribosome complex. Denne metoden gis høy oppløsning utskillelse av Peptid fragmenter slik at identifisering av 80-90% av proteiner i denne spesielle gjær Ribosom kompleks. Coupling microfluidic devices to MS is a further strategy that combines sample handling and separation, as well as interfacing neatly with nano-ESI-MS analysis.A different approach for selective protein fractionation and identification uses ProteinChip technology (Ciphergen) which employs a surface capture method using antibodies or chemically modified surfaces to capture specific classes of proteins which are then analysed by MALDI-MS. Coupling microfluidic enheter til MS er en ytterligere strategi som kombinerer eksemplar håndtering og separasjon, samt tilkopling pent med nano-ESI-MS analysis.A annen tilnærming til selektiv protein fractionation og identifikasjon bruker ProteinChip teknologi (Ciphergen) som sysselsetter en overflate fange metode ved hjelp av antistoffer eller kjemisk omdannede flater for å fange opp bestemte klasser av proteiner som blir deretter analysert av MALDI-MS. This technique, known as Surface Enhanced Laser Desorption Ionization (SELDI)-MS35, has great potential for the comparison of the protein content of different samples. Denne teknikken, kalt Surface Enhanced Laser Desorption ionization (SELDI)-MS35, har stort potensial for sammenligning av protein innholdet av ulike eksempler.