Bioinformatics, Protocols, DNA RNA Protein Proteomics Bioinformatikk, protokoller, DNA RNA Protein Proteomikk

Biology Home Protocols Bioinformatic Tools Biology Forums Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark Us! Biologi Hjem Protokoller Bioinformatic Verktøy Biology Forum Molecular Biology Encyclopaedia Molecular Biology Images Bookmark oss!

home > dna > cdna-cloning > index.php home> DNA> cdna-klon> index.php

Molecular Biology Home Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomics Research BETA! Bioinformatics Lab Equipment Molecular Biology Techniques Molecular Biology Products and Services Related Biology Links Molecular Biology Hjem Science News Science Videos DNA RNA Protein Proteomikk Research BETA! Bioinformatikk laboratorieutstyr Molecular Biology Teknikker Molecular Biology Produkter og tjenester relatert Biology Links

Molecular Biology Blog Molecular Biology Blog

Send this page to a friend Send denne siden til en venn

Intracellular Stations Intracellular Stations

Antibody Botany Common Buffers Buffers Alphabetic Bookstore Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis Histology Microarrays Immunology Mass Spectrometry Microbiology Molecular Imaging Peptide Proteomics Protein Microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi and SiRNA Stem Cell Biology Transfection Western Blot Antibody Botany Felles Buffer Buffer Alfabetisk Bokbutikk Cell Biology and Culture Gel Electrophoresis histologi Microarrays Immunology mass spectrometry mikrobiologi Molecular Imaging Peptid Proteomikk Protein microarray Chips PCR Real-Time PCR RNAi og siRNA Stilk Cellen Biology Transfection Western Blot

DNA Protocols DNA Protokoller

DNA Encyclopedia DNA Encyclopedia

DNA Bioinformatics DNA Bioinformatikk

DNA Forum DNA Forum

DNA Blog DNA-blogg

DNA News DNA Nyheter

DNA Books DNA Bøker

cDNA Cloning cDNA Cloning

Learn about cDNA cloning. Lær om cDNA kloning.

cDNA Cloning cDNA Cloning

A cDNA (short for complemantary DNA or copy DNA) is a DNA copy of an RNA, usually an mRNA. En cDNA (forkortelse for complemantary DNA eller DNA) er en DNA-kopi av en RNA, vanligvis en mRNA. Sometimes we want to make a cDNA library, a set of clones reprensenting as many as possible of the mRNAs in a given cell type at a given time. Noen ganger ønsker vi å foreta et cDNA bibliotek, et sett av kloner reprensenting så mange som mulig av mRNAs i en gitt celle type på et gitt tidspunkt. Such libraries can contain tens of thousands of different clones. Slike bibliotek kan inneholde tusenvis av forskjellige kloner. Other times, we want to make one particular cDNA- aclone containing a DNA copy of just one mRNA. Andre ganger ønsker vi å gjøre en bestemt cDNA-aclone inneholder en DNA-kopi av bare ett mRNA. This technique we use depends in part on which of these goals we wish to achieve. Denne teknikken vi bruker, avhenger delvis av hvilket av disse målene vi ønsker å oppnå.

cDNA Libraries cDNA bibliotek

If we want to build a cDNA library, we can use a simple but effective strategy that relies on a process called nick translation. Hvis vi ønsker å bygge en cDNA-biblioteket, kan vi bruke en enkel, men effektiv strategi som er avhengig av en prosess kalt nick oversettelsen. The essence of nick translation is the simultaneous removal of DNA ahead of a nick (a single-stranded DNA break) and synthesis of DNA behind the nick. De essens nick oversettelsen er samtidig fjerning av DNA fremover av et nick (et enkelt-strandet DNA pause) og syntese av DNA bak nicket. The net result is to move, or translate the nick in the 5'-3' direction. Netto resultat er å flytte, eller oversette nick i 5'-3 'retning. The enzyme we usually use the nick translation is E.coli DNA polymerase I, which has a 5'-3' exonuclease activity that allows the enzyme to degrade DNA ahead of the nick as it moves along. Det enzymet vi vanligvis bruker nicket oversettelsen er E.coli DNA polymerase I, som har en 5'-3 'exonuclease aktivitet som gjør at enzymet å degradere DNA i forkant av nick som den beveger seg langs.

The central part any cDNA cloning procedure is synthesis of the cDNA from an mRNA template using reverse transcriptase. Den sentrale delen eventuelle cDNA kloning er syntese av cDNA fra en mRNA mal ved hjelp av reverse transcriptase. Reverse transcriptase is like any other DNA-synthesizing enzyme is that it cannot initiate DNA synthesis without a primer. Reverse transcriptase er som andre DNA-syntetiserer enzymet er at den ikke kan starte DNA-syntese uten grunning. To get around this problem, we take advantage of the poly(A) tail at the 3'-end of most eukaryotic mRNAs and use oligo(dT) as the primer. For å komme rundt dette problemet, kan vi dra nytte av Poly (A) hale på 3'-enden av de fleste eukaryote mRNAs og bruk oligo (dT) som grunning. The oligo(dT) is complementary to poly(A), so it binds to the poly(A) at the 3'-end of the mRNA and primes DNA synthesis, using the mRNA as a template. Den oligo (dT) er komplementære til Poly (A), slik at det binder til Poly (A) på 3'-enden av mRNA og primtall DNA syntese ved hjelp av mRNA som en mal.

After the mRNA has been copied, yielding a single-stranded DNA (the "first strand"), we partially degrade the mRNA with ribonuclease H (RNase H). Etter at mRNA har blitt kopiert, gir en enkelt-strandet DNA ( "første strand"), vi delvis fornedre den mRNA med Ribonuklease H (RNase H). This enzyme degrades the RNA strand of an RNA/DNA hybrid- just what we need to begin to digest the RNA from our first strand cDNA. Dette enzymet forringer RNA strand av en RNA / DNA hybrid-akkurat hva vi trenger for å begynne å fordøye RNA fra vårt første strand cDNA. The remaining RNA fragments serve as primers for making the "second strand," using the first as the template. De resterende RNA fragmenter som første til å gjøre "andre strand," ved hjelp av de første som mal. This is the nick-translation phase of the process and again, E. coli DNA polymerase I is the enzyme we use to carry out the nick-translation reaction. Dette er kutt-oversettelsen fase av prosessen og igjen, E. coli DNA polymerase jeg er enzymet vi bruker for å utføre nick-oversettelsen reaksjon. The net result is a double-stranded cDNA with a small fragment of RNA at the 5'-end of the second strand. Netto resultat er en dobbel-strandet cDNA med et lite fragment av RNA på 5'-enden av den andre strand.
Our next task is to ligate the cDNA to a vector. Vår neste oppgave er å ligate den cDNA til en vektor. This was easy with our pieces of genomic DNA cleaved with restriction enzymes, but cDNAs have no sticky ends. Dette var enkelt med våre deler av Genova DNA cleaved med begrensning enzymer, men cDNAs har ingen fast ender. We can ligate blunt ends together, even though that is a relatively inefficient process. Vi kan ligate sløv endene sammen, selv om det er et relativt lite effektive. However, if we want the efficient ligation afforded by sticky ends, we can tack sticky ends (oligo[dC]) onto the cDNA, using an enzyme called terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) or simply terminal transferase and one of the deoxribonucleoside triphosphates. Men hvis vi ønsker en effektiv ligation gis gjennom trege ender, kan vi tråkle trege ender (oligo [dC]) på cDNA ved hjelp av ett enzym som kalles terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) eller ganske enkelt terminal transferase og ett av deoxribonucleoside triphosphates. In the case, we use dCTP. I tilfelle, bruker vi dCTP. The enzyme adds dCMPs, one at a time, to the 3'-ends of the cDNA. Det enzymet legger dCMPs, ett om gangen, til 3'-endene av cDNA. In the same way, we attach oligo(dG) ends to our vector and allow the oligo (dC)s to anneal to the oligo(dG)s. På samme måte, legger vi oligo (dG) ender til våre vektorgrafikk og lar oligo (dC) s til anneal til oligo (dG) s. This brings the vector and cDNA together in a recombinant DNA that can be used directly for transformation. Dette fører til vektoren og cDNA sammen i et rekombinant DNA som kan brukes direkte for transformasjon. The base pairing between the oligonucleotide tails is strong enough that no ligation is required before transformation. Basestasjon sammenkoblingen mellom oligonucleotide kjole og hvitt er sterk nok til at ingen ligation er nødvendig før transformasjon. The DNA ligase inside the transformed cells finally performs the ligation. The DNA ligase inne i transformerte celler endelig utfører ligation.

See the DNA Molecule in 3-Dimensions Se DNA Molekyler i 3-Mål