De Transfectie van de cel

De transfectie beschrijft de introductie van buitenlands materiaal in eukaryotic cellen gebruikend een virusvector of andere middelen van overdracht.

De term transfectie voor nietvirale methodes wordt vaakst gebruikt in verwijzing naar zoogdiercellen, terwijl de term transformatie de voorkeur heeft de nietvirale overdracht van DNA in bacteriën en niet dierlijke eukaryotic cellen zoals paddestoelen, algen en installaties te beschrijven.

De transfectie van dierlijke cellen impliceert het openen typisch voorbijgaande poriën of „gaten“ in het membraan van het celplasma, om het begrijpen van materiaal toe te staan. Het genetische materiaal (zoals supercoiled plasmideDNA of siRNA concepten), of zelfs de proteïnen zoals antilichamen, kunnen zijn transfected. Naast electroporation, kan de transfectie worden uitgevoerd door een lipide van kationen met het materiaal te mengen om liposomes te produceren, die met het membraan van het celplasma smelten en hun lading binnen deponeren.

De originele betekenis van transfectie was „besmetting door transformatie“, d.w.z. inleiding van DNA (of RNA) van een een eukaryote virus of bacteriofaag in cellen, die in een besmetting resulteren. Omdat de term transformatie een andere betekenis in dierlijke celbiologie (een genetische verandering die propagatie op lange termijn in cultuur, of aanwinst van eigenschappen typisch van kankercellen toestaat) had, de term transfectie wordt verworven die, voor dierlijke cellen, zijn huidige betekenis van een verandering in celeigenschappen die door introductie van DNA worden veroorzaakt.

De transfectie is een methode waardoor experimentele DNA in een beschaafde zoogdiercel kan worden gezet. Dergelijke experimenten worden gewoonlijk uitgevoerd gebruikend gekloonde DNA die codageopeenvolgingen en controlegebieden (promotors, enz.) bevat te testen of DNA zal worden uitgedrukt. Aangezien gekloonde DNA uitgebreid kan gewijzigd te zijn (bijvoorbeeld, kunnen de eiwitbandplaatsen op de promotor veranderd te zijn of worden verwijderd), wordt de transfectie vaak gebruikt om te testen of een bepaalde wijziging de functie van een gen beïnvloedt.

Het Diagram van de transfectie:

De Toepassingen van de transfectie

De capaciteit om RNA in het laboratorium samen te stellen is kritiek aan vele technieken. Radiolabeled en nietradiolabeled sondes van RNA worden vereist voor vele protocollen, en zij kunnen gemakkelijk in kleinschalige transcriptiereacties die in vitro worden samengesteld hun gebruik in vlekkenkruisingen en de analyses van de nucleasebescherming toestaan.

• Vector of DNA
• Cellen
• De Reagens van de transfectie

De transcriptie in vitro vereist een gezuiverd lineair malplaatje dat van DNA een promotor, ribonucleotide trifosfaat, een buffersysteem bevat dat DTT en magnesium omvat

De transcriptie in vitro vereist een gezuiverd lineair malplaatje dat van DNA een promotor, ribonucleotide trifosfaat, een buffersysteem bevat dat DTT en magnesium omvat

De Methodes van de transfectie

Er zijn diverse methodes om buitenlandse DNA in een eukaryotic cel te introduceren. Vele materialen zijn gebruikt als carriers voor transfectie, die in drie soorten kan worden verdeeld: de polymeren (van kationen), liposomes en nanoparticles.

Één van de goedkoopste (en minste betrouwbaar) methodes zijn transfectie door calciumfosfaat, die oorspronkelijk door F.L. Graham en A.J. van der Eb in 1973 wordt ontdekt [nodig citaat] (zie ook [1]). De hEPES-als buffer opgetreden voor zoute oplossing die (HeBS) fosfaationen wordt bevat met een oplossing die van het calciumchloride DNA bevat gecombineerd om te zijn transfected. Wanneer twee worden gecombineerd, zal een fijn precipitaat van het zich positief - geladen calcium en negatief - geladen fosfaat vormen, transfected het binden van DNA om te zijn op zijn oppervlakte. De opschorting van het precipitaat wordt dan toegevoegd aan de cellen om te zijn transfected (gewoonlijk een celcultuur die in monolayer wordt gekweekt). Door een niet volledig begrepen proces, nemen de cellen enkele precipitaat, en met het, DNA op.

Ander methodesgebruik vertakte zich hoogst organische samenstellingen, zogenaamde dendrimers, om DNA te binden en het te krijgen in de cel. Een zeer efficiënte methode is de opneming van DNA om te zijn transfected in liposomes, d.w.z. kleine, membraan-begrensde organismen die op één of andere manier gelijkaardig aan de structuur van een cel zijn en eigenlijk met het celmembraan kunnen smelten, vrijgevend DNA van de cel. Voor eukaryotic cellen, wordt de lipide-kation gebaseerde transfectie typischer gebruikt, omdat de cellen gevoeliger zijn.

Een andere methode is het gebruik van de polymeren van kationen zoals dEAE-Dextran of polyethylenimine. Negatief - geladen DNA bindt aan polycation en het complex wordt opgenomen door de cel via endocytosis.

Een directe benadering van transfectie is het genkanon, waar DNA aan een nanoparticle van een inert (algemeen gouden) vast lichaam wordt gekoppeld dat dan direct in de kern van de doelcel „is ontsproten“. DNA kan ook in cellen worden geïntroduceerda gebruikend virussen als carrier. In zulke gevallen, wordt de techniek genoemd virale transductie, en, de cellen zijn naar verluidt transduced.

Andere methodes van transfectie omvatten nucleofection, electroporation, hitteschok, magnetofection en merkgebonden transfectiereagentia zoals Lipofectamine, Dojindo Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene of DreamFect.

Stal versus de Voorbijgaande Methodes van de Transfectie

Voor de meeste toepassingen van transfectie, volstaat het als gen slechts vluchtig wordt uitgedrukt transfected. Aangezien DNA die in het transfectieproces wordt geïntroduceerdi gewoonlijk niet in het kerngenoom wordt opgenomen, wordt buitenlandse DNA verloren in het recentere stadium wanneer de cellen mitose ondergaan. Als men wenst dat transfected blijft het gen eigenlijk in het genoom van de cel en zijn dochtercellen, een stabiele transfectie moeten voorkomen.

Om dit te verwezenlijken, is een ander gen mede-transfected, dat de cel wat selectievoordeel, zoals weerstand naar een bepaalde toxine geeft. Wat (zeer weinigen) van transfected cellen, toevallig, zullen opgenomen hebben het buitenlandse genetische materiaal in hun genoom. Als de toxine, waarnaar gen mede-transfected weerstand aanbiedt, dan wordt toegevoegd aan de celcultuur, slechts zullen die weinig cellen met de buitenlandse genen die in hun genoom worden opgenomen zich kunnen verspreiden, terwijl andere cellen zullen sterven. Na het toepassen van deze selectiedruk voor wat tijd, slechts blijven de cellen met een stabiele transfectie en kunnen verder worden gecultiveerd.

Een gemeenschappelijke agent voor stabiele transfectie is Geneticin, die ook als G418 wordt bekend, die een toxine is die door het product van het neomycine bestand gen kan worden geneutraliseerd.

De transcriptie in vitro vereist een gezuiverd lineair malplaatje dat van DNA een promotor, ribonucleotide trifosfaat, een buffersysteem bevat dat DTT en magnesium omvat

Uiteinden voor Transfectie

• De inhibitors van RN-ase van het gebruik altijd!
• Het Geld van de besparing met T7 Phage Polymerase van RNA: De klonen met een n-Terminal zijn-6 markering zijn beschikbaar. Als u deze kloon verkrijgt, kunt u hopen van T7 polymerase met hoge activiteit zuiveren (ref: Hij B, Rong M, Lyakhov D, Gartenstein H, Diaz G, Castagna R, McAllister GEWICHT, Durbin RK. Eiwit Expr Purif. 1997, 9, 142-151).
• Om het malplaatje van DNA te verwijderen, gebruik RN-ase-Vrije DNAse. Wij hebben RQ1 DNase (Promega) die 15 minuten wordt toegevoegd gebruikt en het werkt goed. 

Het opslaan van Reagens Trasfection

• RNA wordt het best opgeslagen bij neutrale pH met EDTA.
• TE de buffer wordt geadviseerd (het EDTA van van 10 mm tris-HCl, pH 7.5, 1 mm), nochtans zou dit met gezuiverd vrij van RN-ase moeten worden voorbereid (preferablly Millipore water).

De Problemen van de Transfectie van het oplossen van problemen

Ontbroken Transfecties

• Oude transfectiereagens
• Incorrect opgeslagen transfectieagent
• Slechte kwaliteitsDNA of vector
• Het ontoereikende bedrag van DNA
• Ontoereikende transfectiereagens
• Teveel DNA
• Teveel transfectiereagens

Verwijzingen bij de Transfectie

Verwijzingen bij de Transfectie

1. Bacchetti S, Graham F (1977). „Overdracht van het gen voor thymidine kinase aan thymidine kinase-ontoereikende menselijke cellen door gezuiverde herpes simplex virale DNA“. Natl Acad Sc.i van Proc de V.S. 74 (4): 1590-4. PMID 193108.