De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

De Isolatie van RNA

De Achtergrondinformatie van de Extractie van RNA

Het verkrijgen van hoogstaand, intact RNA is de eerste en vaak kritiekste stap in het uitvoeren van vele fundamentele moleculaire biologieexperimenten, met inbegrip van Noordelijke analyse, de analyses van de nucleasebescherming, rechts-PCR, de afbeelding van RNA, vertaling en cDNA bibliotheekbouw in vitro. Om succesvol te zijn, echter, zou de de isolatieprocedure van RNA sommige belangrijke stappen moeten omvatten allebei before and after de daadwerkelijke reiniging van RNA.

De basis Methodes van de Isolatie van RNA

Afhankelijk van te halen RNA, zijn er eigenschappen van RNA die het om vanaf andere cellulaire materialen zoals proteïnen, DNA en zelfs lipiden toelaten worden geïsoleerdl.

RNA van de boodschapper of mRNA bevatten rekadenosine residu's in de vorm van een polystaart (van A). Dit is geëxploiteerdt om mRNA toe te laten om aan poly de affiniteitkolommen of parels (van T) worden gebonden.

Uiteinden voor de Extractie en de Isolatie van RNA

Als u momenteel een aangewezen methode hebt om RNA te isoleren, blijf het gebruiken.

Als u geen RNA van uw systeem hebt geïsoleerdd alvorens en uw organisme niet op de volgende lijst is, kunnen wij u helpen gevestigde protocollen identificeren die voor het isoleren van RNA voor het Noordelijke bevlekken of rechts-PCR van uw systeem zijn gebruikt. Deze types van protocollen zullen ook „microarray-rang“ RNA opbrengen.

Stel altijd een agarose gel van uw RNA in werking om de kwaliteit te beoordelen.

NOTA: Als u een niet kolom gebaseerde reinigingsreagens zoals TRIzol gebruikt die wij u stort uw RNA een tweede keer van ethylalcohol hebben geadviseerd of u overgaat het door een kolom Rneasy of een gelijkaardig apparaat. Dit verzekert verwijdering van alle organische verontreinigende stoffen (zie hieronder spectrums).

 

De Inhibitors van RN-ase die afzonderlijk de Extractie en Van RNA worden gebruikt

 

Het controleren van de Kwaliteit en de Hoeveelheid van de Isolatie van RNA

De efficiënte kern/cytoplasmic opdeling kan snel door het denatureren agarose gelanalyse (zie Figuur 1) worden beoordeeld. De banden die aan voorloper beantwoorden zouden rRNA in de totale en kernfractie van RNA gelijkwaardig moeten zijn. 18S zal en 28S rRNA banden in de kernfractie van RNA dan in of totaal RNA of cytoplasmic fractieRNA minder intens zijn. In sommige cellenvariëteiten, bijvoorbeeld zullen 293 en cos.-7 cellen, dit verschil dramatisch zijn, maar in andere cellenlijnen zoals HeLa cellen, zijn de rRNAbanden slechts intens lichtjes minder in kernRNA dan in totaal of cytoplasmic fractieRNA. „

De Zuiverheid van RNA

A260 zijn de lezingen en 260/280 verhoudingen niet genoeg om hoge zuiverheidsRNA te verzekeren. U moet een volledig UVspectrum nemen. Hieronder zijn 3 voorbeeldspectrums die allen goed 260/280 verhoudingen hebben, maar zeer verschillende zuiverheid hebben. U kunt de 260/230 verhouding ook gebruiken helpen de hoeveelheid organische verontreiniging in uw RNA bepalen. Het is een veranderlijker aantal dan de 260/280 verhouding, maar over het algemeen, wijzen de verhoudingen boven 1 op goede zuiverheid.

 

Het kwantificeren van de Extractie en de Isolatie van RNA

 

De Isolatie van RNA van Subcellular Fracties

De cellen werden toen gewassen in PBS en haalden opeenvolgend zoals beschreven. Eerst, werden de cellen gehaald met Nonidet p-40 buffer (10 mm van tris-Cl, (pH 7.5), 10 mm van NaCl, 3 mm- MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet p-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mm DTT). De resterende korrel (ruw endoplasmic netwerk (RER) werd en kern) gewassen in de zelfde buffer en werd gehaald in buffer B (10 mm van tris-Cl (pH 7.5), 10 van mm- NaCl, 0.5% (v/v) Nonidet p-40, 40 mmEDTA, 40 units/ml Rnasin, 1 mm DTT). De resterende kernkorrel werd gewassen in de zelfde buffer en werd gehaald met hoge zoute buffer (10 mm van tris-Cl (pH 7.5), NaCl van 0.5 M, 3 mm- MgCl2, 0.5% (v/v) Nonidet p-40, 40 units/ml Rnasin, 1 mm DTT). RNA werd gezuiverd van elke fractie door de STAT van RNA oplossing. Totaal RNA was geïsoleerd gebruikend de reagens RNA-STAT60 (tel.-Test) volgens de instructies die door de fabrikant worden verstrekt. (Verwijzing: Byeong-Churl Jang et al., 2002)

 

De Isolatie die van RNA Protocol CsCl gebruikt

De Buffer van de chaos voor de isolatie van RNA

Voor 100 mls 200 mls

4. 5M thiocyanaat 53.2 g 106.4 het EDTA 0.5M 10 mls 20 van Guanidinium 2% van n-Lauroylsarcosine (sarcosyl) 2.0g 4.0g 50mM mls25mM tris-HCl, pH 7.5 1M 2.5 mls 5 mls

0. 1M B-mercaptoethanol 700ul 1.4mls

0. 2% antifoam A (Sigma) 200 ul 400 ul

5. het Definitieve Volume van 7 M CsCl cushion* 100 ml

5. 7 M „Gebakken“ CsCl 95.8g

0. 1M EDTA 0.5M 20 mls

De Procedure die van de Extractie van RNA CsCl gebruikt

* Het behandelde water van het gebruik DEPC en gebakken glaswerk. Deze oplossing, absoluut, moet positief vrije RN-ase zijn. RN-ase is overal! Handschoenen van de slijtage, gebruik bakten slechts glaswerk, of maagdelijk plastiek. DePC behandelt uw water, buffers (behalve Tris). Zeer zorgvuldig ben.

1. Weeg dierlijk. Verwijder orgaan (lever), is gewicht Één superieure attributen van cDNA u vermindert de geningewikkeldheid door een orgaan te kiezen dat slechts één enkele plaats van een multilocusenzym uitdrukt. 2. Homogeniseer snel weefsel in buffer van de „Chaos“ (9mls) 3. Spin homogenant bij 12 kg om onoplosbaar materiaal 4 te verwijderen. TERWIJL Homogenant 4A SPINT. Gewicht uit 1.8 g van CsCl (0.2g/ml) per steekproef. 4B. In de ultracentrifugebuis („snel-verbinding“) voeg 3.5mls van 5.7M CsCl „kussen“ toe Deze laag vrije RN-ase moet zijn. U zult uw RNA door deze laag centrifugeren en om het even welke verontreiniging zal significante verliezen veroorzaken. 5. Verwijder supernant, gezet in verse buis, voeg 1.8 g CsCl 6 toe. Zorgvuldig, voeg homogenant bovenop het kussen CsCl toe. Dit wordt het gemakkelijkst verwezenlijkt door een 10cc spuit en een lange naald te gebruiken. Plaats naald/spuit in snel-verbindingsbuis, en voeg homogenant weefsel aan de spuit toe. Homogenant zal langzaam in buis q-s dat druppelen, bovenop het kussen drijft.

7. Zorgvuldig, paste het saldo paren van centrifugebuis (aan +/0.005 g).

8. Buizen van de verbinding, plaats pasten buizen tegenovergesteld van elkaar en GLB met rode aluminiumbovenkanten aan.

9. Centrifugeer, 50.000 rpms 5.5 u, 20oC

Na centrifugeren: De buizen van het teken waar de korrel zou moeten zijn: aan de bodem buitenkant (met betrekking tot centrum van rotor)

10. Verwijder buizen, plaats in geschikt rek.

11. Plak van de bovenkant van buis. Zuig van hoogste 2/3 3/4 van oplossing op. HET WERK VANAF TOP DOWN. HET IS BELANGRIJK DAT U VAN HET BOVENLEER EERST DE MEESTE OPLOSSING OPZUIGT EN ALLES BEHALVE HET DUIDELIJKE KUSSEN VERWIJDERT. ZUIG NIET DE ONZICHTBARE KORREL BIJ DE BODEM OP.

12. Snijd hoogste 2/3 van buis af. Gebruikend een „getrokken“ Pasteur pipet, verwijder zorgvuldig het blijven oplossing. De korrel zal op de onderkant van de buis zijn.

13. De korrel van de spoeling met 70% EtOH, verwijdert (het gebruik Pasteur pipets), tweemaal herhaalt (totale 3 wassen)

14. Voeg ul 200 van 0.1x TE (vrije RN-ase) toe, pipet gebruiken uiteinde om korrel en „het titreren van“ de poging van de TE te verpletteren om korrel in oplossing te zetten. Vorm minstens een heterogeene oplossing en zet in een verse microfugebuis.

15. Herhaal met ul 200 van de TE samenvoegend beide oplossingen

16. De draaikolk, goed RNA houdt niet van in oplossing te gaan. Het geduld is een deugd.

17. Bepaal concentratie, ul 10 in ul 490 (500 ul definitief volume)

18. Verwijder 1 tot 2 ug van RNA voor gelanalyse (voeg de ladingsbuffers toe van RNA)

19. Voeg 1/10 volumeRN-ase vrije 3M NaOAC (ul 40) toe, 2.5 volumes van EtOH (1.0ml). Mengeling krachtig.

20. U kunt de concentratie van RNA in EtOH.Thus berekenen, is er geen behoefte om elk van uw RNA meteen te storten. Verwijder ongeveer 1.5 tot 2 keer enkel het bedrag u door oplossing vortexing EtOH/RNA wenst en het aangewezen volume verwijdert. Deze oplossing EtOH/RNA die bij 20oC wordt opgeslagen of vermindert jarenlang, is stabiel.

Zie:

De Protocollen van RNA

De Bio-informatica van RNA