De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

De Gelen van RNA

Auteursrecht 2007 - Moleculaire Post

 

Geschiedenis van de Elektroforese van het Gel van RNA

De Gelen van RNA zijn gebruikt voor decennia kwalitatief de kwaliteit van RNA uit te scheiden en te beoordelen die van steekproeven wordt geïsoleerdd. Als u niet zeker bent welk RNA controle is:

De AUDIO luistert aan een gedetailleerde Verklaring van RNA! en zie ons de encyclopedieartikel van RNA.

De Elektroforese van het Gel van RNA - Achtergrondinformatie

Na isolatie van de steekproeven van RNA, wordt de kwaliteit van de geïsoleerdel voorbereiding van RNA gewoonlijk beoordeeld door elektroforese op een het denatureren agarose gel. Hoewel de resultaten hoofdzakelijk kwalitatief zijn, kunt u wat informatie over de opbrengst van RNA eveneens worden.

Het denatureren de gelen worden gebruikt omdat RNA om op zich neigt te vouwen en uitgebreide en stabiele secundaire structuur te vormen via het intramoleculaire basis in paren rangschikken. Deze secundaire structuur van RNA verhindert het hoofdzakelijk volgens zijn grootte te migreren.

Zorg ervoor dat u een positieve controle van RNA op het gel omvat, in het geval dat u ongebruikelijke resultaten krijgt kunt u dan bepalen of het probleem met het gel was of een probleem met RNA was u analyseert. U kunt het moleculegewichttellers van RNA, een steekproef ook gebruiken van RNA intact die wordt gekend om te zijn, of allebei, kunnen met deze bedoeling worden gebruikt.

De gelen van RNA worden gevisualiseerd met ethidium bromide dat aangezien ethidium het bromide tussen de secundaire structuur van de molecules van RNA inlast en RNA om onder UVlicht toelaat worden gezien bevlekt.

RNA wordt gescheiden uit door gelelektroforese (gewoonlijk agarose gelelektroforese). Na het runnen van een gel van RNA kunt u een noordelijke vlek met verdere overdracht aan membraan leiden, kruising met sonde, en tenslotte opsporing. Of eenvoudig (en veel sneller), vlek voor RNA ethidium bromide of SYBR gebruiken (of gelijkaardige kleurstof die - beter aangezien het niet-toxisch en veiliger is).

 

Toepassingen van de Gelen van RNA

Aangezien de noordelijke vlekken vervelender zijn te voltooien dan de gelen van RNA en PCR in real time, worden zij gebruikt zo veel niet aangezien RNA gelatineert.

De het gelelektroforese van RNA en zijn variaties worden gebruikt in moleculair biologieonderzoek:

• RNA te ontdekken
• analyse voor geïsoleerdeo kwaliteit van RNA
• sta voor algemene bepaling van de hoeveelheid of de opbrengst van RNA toe
• analyse voor de degradatie van RNA

Nadelen van de Gelen van RNA

De nadelen van het gebruiken van het gelelektroforese van RNA omvat:

• De gelen van RNA zijn niet zeer kwantitatief. U kunt de opbrengst van RNA precies bepalen niet of zelfs met normen bedragen. De radioactieve methodes zoals noordelijke het bevlekken of puntvlekken zijn nauwkeuriger.
• Vaak ethidium wordt het bromide gebruikt om RNA te ontdekken. Ethidium het bromide is een biohazard aangezien het mutageen en giftig is.
• De gelen van RNA staan voor een snelle bepaling van de opbrengst van RNA toe nochtans zijn niet zo snel zoals UVspectrofotometrie of andere methodes.

Voordelen van de Gelen van RNA

De voordelen van de Gelen van RNA omvatten:

• Het is een wijd toegelaten methode
• De gelen van RNA zijn zeer snel en gemakkelijk te presteren
• U kunt voor de kwaliteit van RNA binnen 1-2 uren analyseren
• Als u SYBR of een andere niet-toxische vlek (d.w.z. gebruikt u Ethidium geen Bromide) gebruikt, zijn de Gelen van RNA vrij veilig.

Het Protocol van het Gel van RNA

Om de integriteit van uw RNA te verifiëren zou u een „Noordelijke vlekken“ analyse moeten maken. om dit te verwezenlijken moet u een het denatureren gel in werking stellen.

Voor mini-Gelen aan Midi-Gelen van het gebruik van RNA: Maak 50 ml-100mL

Voor mega-Gelen maak 400 ml.

 

Voor (het meest meestal) in werking gesteld Gel 100mL u moet 1g van agarose toevoegen om 1% agarose oplossing te maken.

 

Het lopende Recept van de Buffer voor de Gelen van RNA

Om voorbereidingen te treffen:	500mls	750 mls	1.5 liter
1X de buffer van E (50X) - hieronder	10 ml	15 ml	30 ml
0.66M formaldehyde (1/19 van volume)	26.3 ml	39.5 ml	79 ml

Het Denatureren van RNA Reagentia

Om 400ul van het denatureren van RNA voor te bereiden reagens:

Voeg het volgende toe:

• 80% foramide-Gedeioniseerde 300ul
• 3.7% formaldehyde 40 ul
• 1X 50X buffer 8 van E ul
• dH2O = 400ul 52ul

50 de buffer van X E per liter

Voeg toe:

• 0.9 M Na2 HPO4 Tweebasische 127.8 g
• 0.1M NaH2PO4 Monobasic 13.8 g

Protocol: Stappen in het Voorbereiden van een Gel van RNA

1. gezette agarose in oplossingen.
2. Hitte voorbereide oplossing in weefsel-gestopte fles
3. Laat koel aan 60°C
4. Voeg Formaldehyde aan gelijke 0.66M 2.7 ml 4.0 5.3 21.2 toe
5. (Voeg Ethidium Bromide toe als u het in fles gebruikt)
6. Giet gel (in kap indien mogelijk).
7. Verwarm 2 ug van RNA bij 75°C voor 10 min., dan snel koel. (dit zal RNA om toestaan te denatureren en single-stranded te blijven).
8. Voeg toe: 2.5 volume van het denatureren van RNA reagens
9. Voeg 1/10 volume van ladingskleurstof aan steekproeven toe.
10. Laad steekproeven op agarose gelputten.
11. Stel Gel (gewoonlijk 100V volts) 30minutes-2 uren in werking. (RNA dat van de Controle gebruikend kleurstoftellers loopt)

Uiteinden voor de Gelen van RNA

Stel altijd een agarose gel van uw RNA in werking om de kwaliteit te beoordelen. Niet alleen vertrouwen slechts UVspectrofotometrieresultaten.

* Gebruik DEPC behandeld water en gebakken glaswerk voor alle stappen. De buffers moeten vrije RN-ase of gebruiksMilipore gezuiverd water zijn als u in een stormloop bent. RN-ase is overal! Handschoenen van de slijtage, gebruik bakten slechts glaswerk, of maagdelijk plastiek. DePC behandelt uw water, buffers (behalve Tris). Zeer zorgvuldig ben.

 

De Gelen van RNA van het oplossen van problemen

Als u momenteel een aangewezen methode hebt om RNA in werking te stellen, blijf het gebruiken.

Bespreek en post problemen of vragen over de Gelen van RNA in het Forum van de Protocollen van RNA.

De Verwijzingen van het Gel van RNA