PCR in real time

PCR in real time is een type van kwantitatieve PCR die de hoeveelheid cDNA of mRNA in een steekproef, of van een bevolking van cellen (weefsel of celcultuur), of onlangs zelfs van single cell meet. De real time wordt gebruikt algemeen om de uitdrukking van mRNA van een gen, en zijn uitdrukkingsniveaus (exemplaaraantal van mRNA) tijdens bepaalde voorwaarden (zoals het behandelen van cellen met een drug) te bepalen.  PCR in real time kan worden gebruikt om normale (controle) steekproeven bij ziektesteekproeven te vergelijken, die een idee in verband met uitdrukkingsveranderingen geven die met pathogenese voorkomen.  PCR in real time wordt toe te schrijven aan zijn gevoeligheid ook gebruikt in de opsporing van ziekteverwekkers in het bloed zoals virussen.

De ontwikkeling van kwantitatieve PCR in real time heeft de veranderlijkheid traditioneel verbonden aan kwantitatieve PCR geëlimineerdj, zo toestaan
routine en betrouwbare kwantificatie van PCR producten.

Inhoudstafel

Elk celtype expressess een reeks mRNA molecules, die als een transcriptome wordt bekend.  In antwoord op stimuli, kunnen de cellen factoren zoals eiwitenzymen binnen de cel omhoog-regelen of beneden-regelen door de mRNA niveaus van deze factoren te regelen.  mRNA de niveaus zijn niet altijd gecorreleerd met eiwitniveaus zodat is wat voorzichtigheid noodzakelijk, nochtans over het algemeen mRNA beantwoorden de niveaus los aan eiwitniveaus.  Het meten van de mRNA niveaus van bepaalde factoren binnen een cel die pcr in real time gebruikt is een methode die aanwijzingen in verband met de hoeveelheden deze factoren of proteïnen zal geven.

Traditioneel, mRNA werden de niveaus binnen de cel gemeten gebruikend het Noordelijke bevlekken.  Deze techniek wordt beschouwd als gouden-norm in de meting van genuitdrukking/mRNA niveaus aangezien het radiolabeled sonde gebruikt om RNA te etiketteren, dat dan gebruikend een tegen fonkeling die zeer nauwkeurige lezingen geeft wordt gekwantificeerd. Het noordelijke bevlekken hoewel zeer nauwkeurig had verscheidene nadelen met inbegrip van het gebruik van radioactiviteit. Het noordelijke bevlekken vereiste de nauwkeurige meting van mRNA en totaal RNA van cellen worden gehaald die steekproeven te vergelijken. Dit was een probleem omdat hoewel de opsporingsmethodes zeer nauwkeurig waren, de fout in het Noordelijke bevlekken (of punt van RNA/groef die de bevlekken) door verschillen in totale niveaus RNA/mRNA tussen steekproeven (d.w.z. celbehandelingen, verschillende weefsels, verschillende dieren, enz.) zou kunnen worden geïntroduceerdw.  Het vereiste ook vrij hopen van RNA die grote aantallen cellen vereisten. Onlangs, mRNA zijn de gengetalsmatige weergave of pcr methodes de in real time verbeterd en geweest gemakkelijker te presteren en vereisen niet het gebruik van radioactiviteit.  De onderzoekers vaak hebben slechts toegang tot kleine hoeveelheden cellen vooral op het gebied van het onderzoek van de stamcel en primaire celonderzoek, en pcr in real time heeft het mogelijk gemaakt om mRNA niveaus van zelfs zeer kleine aantallen cellen en onlangs zelfs enige cellen te kwantificeren.  Nochtans, deze extreme gevoeligheid van pcr methodes in real time het essentieel maakt om zijn steekproeven tegen verontreiniging te beschermen, die zou leiden tot valse resultaten. De huidige pcr methodes in real time en de systemen ook vereisen niet de meting van mRNA of cDNA wordt de steekproefconcentraties vóór pcr in real time geleid.

Higuchi et al.1, 2 bereidden de analyse van PCR kinetica door een systeem de weg te construeren dat PCR producten zoals ontdekt
zij accumuleren. Dit systeem „in real time“ omvat het intercalatorethidium bromide in elke versterkingsreactie,
een aangepaste thermische cycler om de steekproeven met ultraviolet licht te bestralen, en opsporing van de resulterende fluorescentie
met een computergestuurde gekoelde camera CCD. De versterking veroorzaakt stijgende hoeveelheden double-stranded
DNA, die ethidium bromide bindt, resulterend in een verhoging van fluorescentie. Door de verhoging van fluorescentie in kaart te brengen
tegenover cyclusaantal, veroorzaakt het systeem versterkingspercelen die een vollediger beeld van verstrekken
PCR proces dan het analyseren productaccumulatie na een vast aantal cycli.