Westelijke Vlek

Leer nu al het andere daar over westelijke vlekken is!

- Steekproef Prepartation

- Het Lysing van Buffer

- Antilichaam

- Het Lysing van Cellen

- De Voorbereiding van het gel

- Lopend Gel

- Overdracht van Gel

- Controles

- Westelijke Vlek

- Lezen

- Analyse en Interpretatie

Of u nietAdherente Cellen (zoals T-cell lijnen of randbloedcellen) of Adherente cellen (zoals de cellen van de Fibroblast of de cellen van COS.) hebt, moet u vreemde proteïnen uit de media verwijderen. Voor nietadherente cellen kunt u hen zacht korrelen met centrifugeren en dan de korrel met PBS wassen. Voor adherente cellen, eenvoudige was de fles of schotel met PBS voorafgaand aan westelijke vlek.

 

De westelijke vlekkenanalyse onderzoekt proteïnen, en zodat willen wij de proteïnen versie van de cellen zijn en ook de proteïnen verhinderen omhoog door proteasen worden gesneden. Wij hebben deze aan westelijke vlek nodig:

- om dingenkoude te houden! 4C op ijs tijdens cellysis voor het westelijke bevlekken

- gebruiksDetergens om membranen van cellen te verdelen om proteïnen vrij te geven

- Buffer

- Inhibitors (zowel proteaseinhibitors als phosphatase inhibitors als wij westelijke vlek voor fosfoproteïne zullen doen)

 

Detergens dat - Cellen voor Westelijke Vlek Lysing

SDS en RIPA zijn detergentia die worden gebruikt om proteïnen voor recentere analyse oplosbaar te maken gebruikend het westelijke bevlekken. Dit wordt vereist aangezien vele proteïnen of binnen de cel of de gevestigde binnencelmembranen zijn, zodat moeten wij deze proteïnen vrijgeven om aan immunoblot voor hen te kunnen.

U zou een Antilichaam moeten selecteren voor Westelijke Vlek te gebruiken. Gewoonlijk of worden de muis monoclonal antilichamen of de konijn polyclonal antilichamen gebruikt.

U kunt of een antilichaam zonder enige toegevoegde groepen gebruiken, of een antilichaam gebruiken dat aan biotine wordt vervoegd. Deze antilichamen vereisen niet

 

Polyclonal versus Monoclonal Antilichamen voor Westelijke Vlek

Monoclonal Antilichamen zijn gewoonlijk beter voor het Westelijke Bevlekken wegens:

- beter signaal aan lawaaiverhouding (lagere achtergrond in westelijke vlek)

- hun hogere specificiteit (u krijgt minder die proteïnen of Ig vervuilen)

- algemene schonere resultaten op de westelijke bevlekkende film (minder niet-specifieke ontdekte banden)

 

Polyclonal Antilichamen zijn beter geschikt voor Immunoprecipitation:

- zij erkennen meer epitopes

- hebben hogere avidity

UITEINDEN alvorens u voor het westelijke bevlekken lyse:

Als u naar westelijke vlek voor eiwitmassa (d.w.z. een proteïne die niet phosphorylated) is gaat:

- u kunt lyse in grotere volumes die (de rest voor andere proteïnen houden te bevlekken)

 

Als u naar westelijke vlek een fosfoproteïne (of phosphorylated proteïne) gaat het is belangrijk om het volgende te doen:

- zorg u gebruiken phosphatase inhibitors ervoor (zoals vanadate omdat phosphatases de fosfaten uit uw proteïnen zullen verwijderen! )

- lyse ook cellen in het kleinste volume mogelijke (lyse d.w.z. in de buffer van de 100 ullading, wordt dit gedaan omdat u de meeste cellen kunt laden u lysed. Dit is belangrijk aangezien het signaal wanneer het westelijke bevlekken voor fosfoproteïne. vrij zwak is)

 

Als u eiwit-eiwitinteractie bekijkt:

- gebruik geen SDS aangezien het eiwit-eiwitinteractie scheidt en zo de proteïnen worden gedenatureerd (vooral na het koken)

- voor westelijke bevlekkende eiwit-eiwitinteractie, d.w.z. moeten de inheemse interactie u een minder-stringent detergens gebruiken dergelijke RIPA.

 

Het Lysing:

- kan direct op de plaat of de schotel worden gedaan

- korrel de cellen

- Houd op Ijs en koude - gebruik een ijsemmer

- Vuistregel voor hoeveel lysis de buffer aan gebruik is: 10^5 cellen/uL van lysis buffer

- verzamel in eppendorfbuizen en etiket (houd deze op ijs)

 

Meet totale proteïne vóór de Westelijke Analyse van de Vlek:

- dit staat meer kwantitatieve analyse toe als u behandelingsvoorwaarden in westelijke vlekkenanalyse wilt vergelijken

- de commerciële uitrustingen zijn beschikbaar zoals een analyse van Bradford voor het meten van totale proteïne (van bio-Rad)

- 0.1% van SDS of groter kan zich in eiwitmeting mengen

 

Denatureer EiwitSteekproeven:

- voeg de eiwitbuffer van de ladingssteekproef aan een gedeelte van cel toe lysate - bevat kleurstof (zie ook de migratie op een gel, 2% SDS)

- voeg bisulfide verminderende agent zoals bèta toe - mercaptoethanol

- Kook in water - bad of het verwarmen blok (de lagere temperaturen zoals de graden van midden '90 verminderen eiwitsamenvoeging).

- Por een gat in GLB van elke buis om het knallen te verhinderen

 

Sds-PAGINA zijn de Gelen gelmatrijzen die aan afzonderlijke proteïnen door grootte in aanwezigheid van elektrische stroom worden gebruikt. Het lage percentage gelatineert afzonderlijke grotere proteïnen terwijl het hogere percentage afzonderlijke kleinere proteïnen beter gelatineert. Het probleem is dat alle proteïnen geladen geassociÃërd met hen hebben, en in een elektrostroom kon dit problemen veroorzaken. Dit wordt opgelost door de toevoeging van SDS aan de eiwitsteekproeven. SDS bindt aan elke proteïnen weinig aminozuren en neutraliseert de lastenverschillen die de proteïnen hebben. Dit laat proteïnen toe om door grootte en niet door last worden gescheiden.

- afhankelijk van hoeveel proteïne u voor het westelijke bevlekken zult willen laden, u kleine kammen of grotere kammen zou moeten gebruiken.

- het percentage van acrylamide is belangrijk. Gewoonlijk 10% wordt acrylamide gebruikt.

- Een het oplossen gel wordt gebruikt bij de bodem met pH van 8.8

- Een het stapelen gel (4-5%) wordt pH 6.8 gebruikt om proteïnen na lading binnen samen in te pakken

- De polymerisatie van gelen wordt verhoogd met de katalysators APS en TEMED die de polymerisatiereactie (vorming en verharding) van het polyacrylamidegel versnellen.

- Laad elke Steekproef om steekproef zorgvuldig en langzaam te verhinderen lek uit de steeg.

- Laad elke steeg en buffer van de gebruikssteekproef in elk (om verschillen binnen te verhinderen).

1. Centrifugeer steekproeven voor 10 seconden na het koken.
2. Laad steekproef in elke steeg
3. Laad de verwijzing van mw
4. Stel gel bij in werking 100V (constant voltage) of zelfs beter bij 40 mA (constante stroom). Let op eiwitteller/ladder of kleurstofvoorzijde voor wanneer om gel tegen te houden. De constante stroom geeft betere en scherpere resultaten als u de tijd hebt.

- horloge voor bellen tussen glas en onder het gel - dit betekent dat het werkt

- let op voor eiwitmigratie (moeten zou dalen) - als niet u de lood hebt geschakeld en al uw steekproeven kunnen verliezen!

- Neem aanvankelijk langzaam het het stapelen gel (~ 50 Volts) door, geeft dit scherpere banden.

- Loop niet 's nachts

- Oververhit niet het gel (dit veroorzaakt het gel om starheid te verliezen, die tot het slechte resoloving en onscherpe slecht gevormde banden leidt)

Selecteer het Type van Membraan:

Kan één van beiden gebruiken:

- Membraan PVDF voor westelijke vlekken

- Het membraan van het nitrocellulose voor westelijke vlekken

- Nylon nu zelden gebruikt membraan (- kan scheuren)

 

Uiteinden voor het Overbrengen naar Westelijk Membraan:

- De Handschoenen van de slijtage op elk moment! De forceps van het gebruik

- Minimaliseer wat betreft/forceps aan het membraan

 

Van de overdracht bio-rad orde:

(-)
spons op zwarte
filtreerpapier
gel nitrocellulose
filtreerpapier
spons
(+)

Overdracht:

- Houd in 4C koel

- Overdracht 's nachts bij 35 V

- Kan snel in 1 uur bij hoger V overbrengen

Het blokkeren van Membranen staat u toe om signaal te maximaliseren: lawaai verhouding

- slijtagehandschoenen

- Blok met Ladderzatte 5% (non-fat droge melk - poeder) of 1 - 5% BSA (de Albumine van het RunderSerum) voor phosphorylated proteïnen.

- De buffer is TBST

Het wassen na het Blokkeren

- de was na het blokkeren van stappen is niet kritiek, als mensen vaak blok tijdens primaire antilichamenincubaties.

- de was wordt gewoonlijk gedaan met buffer TBST. Kan snel met een groot volume van TBST worden gedaan.

Incubatie met Primair Antilichaam

- muis, konijn of andere soorten

- gewoonlijk 1: verdunning 1000 met TBST

- als de hoge achtergrond/vele niet-specifieke banden een probleem zijn, kunnen de incubaties met 5% BSA of Melk worden gedaan.

Het wassen na Primair Antilichaam

- niet zo kritiek

- kan snel met grote volumes van TBST wassen

Incubatie van Secundair Antilichaam

- gewoonlijk verdunde 1: 10, 000 met TBST

- anti-muis, anti-konijn, of ander antilichaam dat met enzym HRP voor opsporing wordt vervoegd

Het wassen na Secundair Antilichaam

- KRITIEK

- Was 5 X 5 minuten met TBST.

- Als u werkelijk moet meeslepen, was minstens 3 keer met grotere volumes van TBST.

Het analyseren voor Resultaten

- gewoonlijk wordt ECL (Verbeterde Chemiluminescentie) gebruikt

- de film wordt blootgesteld en ontwikkeld. De blootstelling 10 seconden is gewoonlijk genoeg voor totale proteïne. De fosfoproteïne kunnen 2 - 20 minieme blootstelling vereisen.

- de film is gewoonlijk XOMAT of gelijkaardige „snelle“ film

WB - westelijke vlek

IB - immunoblot (een andere termijn voor het westelijke bevlekken)

SDS - Dodecyl Sulfaat van het Natrium (een detergens dat in vele westelijke bevlekkende oplossingen wordt gebruikt)

PAGINA - de Elektroforese van het Gel Polyacrilamide

Ab - Antilichaam (de antilichamen worden gebruikt om uw proteïne van belang te ontdekken)

HRP - De Peroxidase van de Mierikswortel

Luminol - substraat dat HRP splijt om lichte vorming te veroorzaken

ECL - Verbeterde Chemiluminescentie (westelijke vlekkenoplossing die lichte vorming van HRP + Luminol verbetert)

kD/kDa - kilodalton (het meeste proteïnengemiddelde tussen kDa 30 - 80)

RAM - konijn anti-muis Ig

Ig - Immunoglobulin (antilichamenisotype)

Np-40 - Nonidet p-40

PMSF - phenylmethylsulfonylfluoride

BSA - de Albumine van het RunderSerum

NFDM - Non-fat droge Melk