Bio-informatica, Protocollen, RNA EiwitProteomics van DNA

Referentie van de Beelden van de Biologie van de Encyclopedie van de Biologie van de Forums van de Biologie van de Hulpmiddelen van Bioinformatic van de Protocollen van het Huis van de biologie de Moleculaire Moleculaire ons!

huis > proteïne > eiwit-protocollen > westelijk-bevlekkend > index.php

Het moleculaire Onderzoek Proteomics van RNA van DNA van de Video's van de Wetenschap van het Nieuws van de Wetenschap van het Huis van de Biologie Eiwit BÈTA! Producten van de Biologie van de Technieken van de Biologie van de Apparatuur van het Laboratorium van de bio-informatica de Moleculaire Moleculaire en de de Diensten Verwante Links van de Biologie

Moleculaire Biologie Blog

Verzend deze pagina naar een vriend

Intracellular Posten

Peptide van de Weergave van de Microbiologie van de Spectrometrie van de Massa van de Immunologie van Microarrays van de Histologie van de Elektroforese van het Gel van de Biologie en van de Cultuur van de Cel van de Boekhandel van de Buffers van de Buffers van de Plantkunde van het antilichaam de Gemeenschappelijke Alfabetische Westelijke Vlek van de Transfectie van de Biologie van de Cel van de Moleculaire PCR van de Spaanders Microarray van Proteomics EiwitPCR Stam RNAi en SiRNA In real time

Westelijke Vlek

 

De westelijke Protocollen van de Vlek

Het westelijke Forum van de Vlek

De westelijke Producten van de Vlek

De westelijke Boeken van de Vlek

Het westelijke Oplossen van problemen van de Vlek

De westelijke Boeken van de Vlek

 

Westelijk Bevlekkend Protocol

Het protocol van de westelijk-vlek

Voorbereiding van Steekproeven voor sds-PAGINA de Elektroforese van het Gel van Voorbereide Cel Lysates

1. Bereid gelen voor sds-PAGINA voor
2. Bereid 1X lopende buffer voor
3. Voeg 50 ml bèta-mercaptoethanol aan de buffer van de 950 mlsteekproef (toe voor 1 ml). (slechts als u bèta-mercaptoethanol niet aan steekproefbuffer hebt pre-toegevoegd)
4. Voeg steekproefbuffer aan elke steekproef toe (bepaal hoeveel steekproef vooraf u kunt goed laden per - dun de kammen BioRad kunnen over 30uL behouden. De grote kammen kunnen accomate tot 50uL).
5. De steekproeven van de draaikolk kort.
6. Por een gat in GLB van elke buis (om de bovenkanten te verhinderen knallend wanneer het koken)
7. Kook in het verwarmen van blok/water - bad bij (95°C) 5 minuten (de lagere temperaturen zijn getoond om niet-specifieke eiwitsamenvoeging te verhinderen)

Na Kokende EiwitSteekproeven - Lading en het Runnen van het sds-PAGINA Gel

1. Centrifugeer steekproeven 1 minuut bij hoge snelheid.
2. Laad steekproef in elke steeg.
3. De verwijzing laad van mw (moleculegewichtladder). (u kunt willen
4. Stel gel bij in werking 100V (100V door het stapelen van gel, kan het voltage worden verhoogd tot 200V wanneer het lopen in het scheiden van gel met overvloed van het runnen van buffer)

Overdracht van EiwitSteekproeven aan Membraan

1. Bereid 1X de buffer van de Overdracht voor
2. Doorweek en schud gel in de buffer van de Overdracht voor 15 min
3. Doorweek nitrocellulosemembraan (of PVDF) en (extra dik) filtreerpapier voor verscheidene notulen.
4. Plaats sandwich op overdrachtcel:

Extra dik DUIDELIJK filtreerpapier
Membraan
Gel
Extra dikke filtreerpapierZWARTE

5. Elektrische overdracht: 35V overnite of 90V 1 uur afhankelijk van de grootte van uw proteïne of uw geduld!

Westelijke Bevlekkende Protocol of Immunoblotting

1. Bereid 1X TBST van voorraadoplossingen voor.
2. Bereid blokkerende buffer (3% de Albumine van het RunderSerum of 5% (de Ladderzatte) voor melk van de bevlekken-Rang in TBST). (u kunt verscheidene willen proberen het verschillende blokkeren tijden en voorwaarden).
3. Was membraan in 1X TBST met het schudden voor 10 min.
4. Blok bij kamertemperatuur 1 uur met het blokkeren van buffer (het schudden of cirkelrotator)
5. Broed uw membraan (PVDF of nitrocellulose) 's nachts met primair 1°Ab antilichaam (voor het moeilijke bevlekken conditioneert d.w.z. phosphorylation van proteïnen) of 1 uur voor (gemakkelijke voorwaarden zoals totale proteïne) bij 4°C (overnite) of kamertemperatuur (1 uurincubatie slechts) uit die met saran omslag (het zachte schudden) wordt behandeld. U kunt plastic tonnen van de dollaropslag voor dit (gebruik deze slechts voor het bevlekken!) gebruiken of de doosbodems van de gebruikspipet. De verdunning voor primair antilichaam is rond 1:1000. Zie de instructies van de fabrikant.
6. Was met 1X TBST 3 X 15 min
7. Broed uw membraan (PVDF of nitrocellulose) met secundair antilichaam, 2° Ab voor 30 - 45 min of (1 uur - voor moeilijke bevlekkende voorwaarden) bij kamertemperatuur uit. De verdunning voor secundaire antilichamen is gewoonlijk 1:10,000 of hoger. (d.w.z. 1uL van secundair in 10mL van TBST per membraan) zie de instructies van de fabrikant.  U kunt uw antilichaam aan het blokkeren van oplossing willen toevoegen om niet-specifieke band te verminderen vooral als u hoge achtergrond in uw eerste experiment kreeg.
8. Was met TBST   4-5 X 10 min. Dit is de belangrijkste wasstap.
9. ECL (5min)
10. Stel aan film bloot. Gewoonlijk is de blootstellingstijd van westelijke vlekken ongeveer 10-30 seconden. Langer (5-10 minuten) voor phosphorylation. Als u een werkelijk zwak signaal hebt, of u moet meer proteïne laden of proberen om blootstellingstijd (tot 30 minuten - u kunt proberen verlatend het in een langere cassette) te verhogen.
11. Houd uw membraan! U kunt uw membraan in TBST 1X in de koelkast voor een tijdje houden. U kunt het om de volgende redenen nodig hebben: 1) het controleren van lading (document de recensenten kunnen om totale proteïne of een ladingsnorm zoals actin vragen). Ook, kunt u aanvankelijk voor een fosfoproteïne en dan een strook en reprobe voor totale proteïne sonderen.

Zie ook ons Westelijk Bevlekkend Ontdoend van Protocol van het Membraan