Immunoprecipitation

De steekproeven kunnen dan na precipitatie en centrifugeren worden gewassen. De precipitaten kunnen dan op sds-PAGINA gelen met eiwitsteekproefbuffer worden in werking gesteld. Gewoonlijk zijn de eiwitsteekproeven radiolabeled voorafgaand aan cellysis. Dit wordt gedaan door radiolabeled aminozuren aan cellen gewoonlijk toe te voegen. Dit maakt dingen eenvoudig aangezien de proteïne dan gemakkelijk op film wanneer in werking gesteld op een gel als vlek zal uitzenden radioactiviteit en zal blootstellen film wordt ontdekt. U kunt dan voor de grootte van de proteïne (in moleculegewicht met vergelijking aan groottenormen), en hoeveelheid (door behandelde steekproeven of bij een norm van hoeveelheden te vergelijken) beoordelen.

Voorts staat de immunoprecipitation procedure ook de concentratie van proteïnen toe die niet zeer overvloedig of moeilijk zijn om het gebruiken van westelijke vlek te ontdekken. IP kan proteïnen tot 10.000 concentreren vouwt aangezien het grote volumes van cel kan vergen lysates en uw proteïne van belang concentreren in een klein precipitaat dat dan voor westelijke vlekkenanalyse of andere methodes kan worden gebruikt.

Toepassingen van Immunoprecipitation:

1) de Bepaling van het moleculegewicht en de hoeveelheid van immunoprecipitated proteïne door SDS-PAGE.

2) Immunoprecipitation wordt gebruikt om voor eiwit-eiwitinteractie te beoordelen. Dit wordt gedaan door voor één proteïne immunoprecipitation, en dan voor een andere proteïne te bevlekken.

3) Getalsmatige weergave van tarief van synthese van een proteïne in cellen door de hoeveelheids radiolabeled proteïne te bepalen die tijdens een specifieke hoeveelheid tijd wordt gemaakt.

4) Immunoprecipitation laat aan concentratie van proteïnen toe die anders moeilijk zijn te ontdekken.

De immunoprecipitation methode kan in verscheidene stappen worden verdeeld:

Afhankelijk van de toepassing van immunoprecipitation of IP, zult u verschillende lysis buffers willen gebruiken.  De keus van lysis buffer is belangrijk en is afhankelijk van de kenmerken van de proteïne van belang.

Als de behoefte aan studiephosphorylation van proteïnen of eiwit-proteïneinteractie, u np-40 zou moeten proberen.

Als u totale proteïneniveaus van een proteïne bestudeert, zou u RIPA moeten proberen.

• 50 mm tris-HCl
• Pas aan pH 7.4 aan
• 150 van mm- NaCl
• 1 mm PMSF
• 1 mmEDTA
• 5 µg/ml Aprotinin
• 5 µg/ml Leupeptin
• 1% Triton x-100
• 1% deoxycholate van het Natrium
• 0.1% SDS

• de Definitieve Concentratie van tris-HCl van 50 mm
• de Definitieve Concentratie van NaCl van 150 mm
• Voeg 1% np-40 toe
• Pas aan pH 8.0 aan

De preclear stap wordt gewoonlijk gedaan voor immunoprecipitation omdat het de hoeveelheid niet-specifieke proteïnen in de cel lysate vermindert. Voorts verwijdert pre-ontruimt ook proteïnen die mogelijke niet-specifieke interactie en een hoge affiniteit voor EiwitA, EiwitG, Immunoprecipitin, Zysorbin kunnen hebben, of de onoplosbare vorm van antilichamen bindende proteïne u aan pull-down uw antilichaam gebruikt. Sommige onderzoekers vinden deze stap onnodig en slaan deze stap over. Probeer pre-ontruimt de eerste keer u immunoprecipitation probeert. Als uw resultaten vrij duidelijk zijn, probeer overslaand pre-ontruimt volgende experiment en zie hoe het blijkt.

Welk antilichaam zou u voor immunoprecipitation moeten gebruiken? Gewoonlijk worden Polyclonal antilichamen gebruikt voor immunoprecipation.

Zijn de antilichaam-antigeen complexen niet zelf onoplosbaar, d.w.z. immunoprecipitation, is geen volledig idee. De antilichamen en hun band aan antigenen zijn oplosbaar in bloed, buffers, en tijdens het immunoprecipitation experiment.  Wat wordt gebruikt om deze complexen uit te storten is onoplosbare antilichamen bindende proteïnen. De proteïnen A en G, werden geïsoleerdr van bacteriën, en binden aan het constante gebied van het antilichaam.

De voorbeelden van onoplosbare antilichamen bindende proteïnen die aan precipitaatcomplexen worden gebruikt in immunoprecipitation zijn:

• Eiwit A
• Eiwit G
• Zysorbin
• Immunoprecipitin

  Het wassen van de complexen wordt gedaan gebruikend RIPA, PBS, iP-Was buffer, of andere buffers afhankelijk van wat u na IP zou willen analyseren. De buffer RIPA is stringenter terwijl PBS minder stringent is.

IP het Recept van de Buffer van de Was

• 10mM Tris; Pas aan pH 7.4 aan
• 1mM EDTA
• 1mM EGTA; pH 8.0
• 150mM NaCl
• 1% Triton x-100
• 0.2mM natrium ortho-ortho-vanadate
• de cocktail van de proteaseinhibitor

Definitieve Nota's voor Immunoprecipitation

  Immunoprecipitation het succes is afhankelijk van de affiniteit van het antilichaam voor zijn antigeen.  Een goed immunoprecipitation antilichaam zal u lage achtergrond geven wanneer u de steekproeven gebruikend andere technieken na IP analyseert.  De onoplosbare antilichaam-bindende gebruikte proteïnen zijn ook zeer belangrijk. Polyclonal antilichamen zijn de beste te gebruiken antilichamen nochtans kunnen de gezuiverde monoclonal antilichamen ook worden gebruikt.  Controleer uw antilichamenverkoper om te zien of werd uw monoclonal antilichaam getest voor immunoprecipitation.

Uiteinden voor Immunoprecipitation

• Het gebruik wordt 2 mlbuizen voor immunoprecipitation aangezien zij storten gemakkelijker gewassen en opnieuw uitgesteld
• Probeer overslaand de pre-ontruimt stap om tijd te besparen
• In plaats van het wassen met iP-Was buffer probeer PBS
• Als u reeds lage achtergrond hebt en uw antilichaam groot is, probeer ip was 2X in plaats van 5X
• Zorg ervoor u zo veel vloeistof uit de eppendorfbuizen wanneer immunoprecipitation was verwijdert