Bio-informatica, Protocollen, RNA EiwitProteomics van DNA

huis > proteïne > immunoprecipitation-protocol > index.php

Immunoprecipitation Protocol

Immunoprecipitation en protocollen.

Basis Immunoprecipitation Protocol IP:

1. Behandel uw cellen

2. Oogst cellen door uL toe te voegen 500 van het oplosbaar maken van buffer, schaaf en ga door spuit een 21 maatnaald X5 tijden over om te homogeniseren.

3. Leid een precipitatie van het TCL (dit zal worden gebruikt om te normaliseren als radiolabeled u de cellen b.v. met s-35)

4. Pre-ontruimt: Pre-ontruim door uL 2 van X, muis of konijn of geitserum (waar X de dierlijke soort waarin het primaire antilichaam) werd opgeheven toe te voegen aan gehele steekproeven is en in een rotator 30 minuten bij kamertemperatuur uitbroedt.

5. Verwijder het serum van X door met 30 uLimmunoprecipitin met 30 minuten omwenteling bij kamertemperatuur uit te broeden.

6. Centrifugeer steekproeven 3 minuten bij 13, 000 t/min.

7. Na centrifugeren, voeg uL 5 van primair antilichaam (anti-y x-specifieke proteïne, waar Y het antilichaam dat in een dier voor uw proteïne van belang wordt opgeheven) is aan supernatants toe en broed 's nachts bij 4 graden van C. uit.

8. Voeg uL 100 van immunoprecipitin aan steekproeven toe. Alternatief kunt u Zysorbin (Invitrogen) gebruiken. (Zysorbin vereist sommige minder belangrijke veranderingen in het protocol)

9. Centrifugeer bij 13, 000 t/min 3 minuten. Verwijder de bovendrijvende substantie.

10. Was korrel 3 X met 1 ml van koude IP wasbuffer (voeg proteaseinhibitors aan wahbuffer voorafgaand aan toe gebruik) met het schudden 5-10 minuten tussen elke was.

11. Gebruik deze korrel op een sds-PAGINA gel in werking te stellen. U kunt de Buffer van de Steekproef SDS (eiwitladingsbuffer) aan dit en lading op gel direct toevoegen na het koken.

 

©2005 Molecularstation.com