De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

Protocol van de Analyse van Bradford het Eiwit

Eiwit Concentratie Determinatino die de Methode van de Analyse van Bradford gebruikt

Materialen voor de Analyse van Bradford

1. Reagens: De analysereagens wordt gemaakt door 100 mg van Coomassie Blauwe G250 in 50 ml 95% ethylalcohol op te lossen. De oplossing wordt dan gemengd met 100 ml 85% fosforzuur en tot 1 L met gedistilleerd water gemaakt. De reagens zou moeten door Whatman geen 1 filtreerpapier worden gefiltreerd en dan in een amberfles bij kamertemperatuur worden opgeslagen. Het is stabiel voor verscheidene weken. Nochtans, tijdens dit keer kan de kleurstof van oplossing storten en zodat zou de opgeslagen reagens v3o3or gebruik moeten worden gefiltreerd.

2. Eiwit norm. De runder γ-globuline bij een concentratie van 1 mg/ml (100 µg/mL voor de micro-analyse) wordt in gedistilleerd water gebruikt als voorraadoplossing. Dit zou moeten worden opgeslagen bevroren bij - 20oC. Aangezien de vochtigheidsinhoud van stevige proteïne tijdens opslag kan variëren, zou de nauwkeurige concentratie van proteïne in de standaardoplossing van zijn absorbering bij 280 NM moeten worden bepaald. De absorbering van a1 mg/ml oplossing van γ-globuline, in een 1 cm lichte weg, is 1.35. De overeenkomstige waarden voor twee alternatieve eiwitnormen, runderserumalbumine en ovalbumin, zijn 0.66 en 0.75, respectievelijk.

3. Plastiek en het glaswerk dat in de analyse wordt het gebruikt zouden absoluut schoon moeten zijn en vrij detergens. Van het kwarts (kiezelzuur) de de spectrofotometercuvettes zouden niet moeten worden gebruikt, aangezien de kleurstof aan dit materiaal bindt. Sporen van kleurstof de verbindend aan glaswerk of plastiek kunnen worden verwijderd door met methanol of detergent oplossing te spoelen.

 

 De standaard Methode van de Analyse van Bradford

1. Pipet tussen 10 en 100 µg van proteïne in totaal volume 100 µL in een reageerbuis. Als de benaderende steekproefconcentratie onbekend is, analyseer een waaier van verdunningen (1, 1:10, 1:100, 1:1000). Bereid duplicaten van elke steekproef voor.

2. Voor de kaliberbepalingskromme, pipet dubbele volumes van 10, 20, 40, 60, 80, en 100 µL van 1 mg/ml γ-globuline standaardoplossing in reageerbuizen, en maak elk tot 100 µL met gedistilleerd water. Pipet 100 µL van gedistilleerd water in een verdere buis om de reagensspatie te verstrekken.

3. Voeg 5 ml van eiwitreagens aan elke buis toe en meng me goed door inversie of verzacht het vortexmixing. Vermijd schuimend, wat zal leiden tot slechte reproduceerbaarheid.

4. Meet A595 van de steekproeven en de normen tegen de reagensspatie tussen 2 min en 1 h na zich het mengen. Norm 100 zou µg een A595 waarde van ongeveer 0.4 moeten geven. De standaardkromme is niet lineair, en de nauwkeurige absorbering variÃërt afhankelijk van de leeftijd van de analysereagens. Derhalve is het essentieel om een kaliberbepalingskromme voor elke reeks analyses te construeren.

De Methode van de micro-analyse Deze vorm van de analyse is gevoeliger voor proteïne. Derhalve is het nuttig wanneer het bedrag van de onbekende proteïne wordt beperkt (zie ook Nota 9). 1. Pipet dubbele steekproeven die tussen 1 en 10 µg in een totaal volume van 100 µL in 1.5-ml polyethyleen microfuge buizen bevatten. Als de benaderende steekproefconcentratie onbekend is, analyseer een waaier van verdunningen (1, 1:10, 1:100, 1:1000).

2. Voor de kaliberbepalingskromme, pipet dubbele volumes van 10, 20, 40, 60, 80, en 100 µL van µg/mLγ-globuline 100 standaardoplossing in microfugebuizen, en pas het volume aan 100 µL met water aan. Pipet 100 µL van gedistilleerd water in een buis voor de reagensspatie.

3. Voeg grondig 1 ml van eiwitreagens aan elke buis en mengeling toe zacht, maar.

4. Meet de absorbering van elke steekproef tussen 2 en 60 min na toevoeging van de eiwitreagens. De A595 waarde van een steekproef die µgγ-globuline 10 bevat is 0.45.

 

zie ook: De EiwitAnalyse van Bradford

Verwijzingen voor de Analyse van Bradford

Gewijzigd van protocol door Nicholas J. Kruger.

De verwante EiwitArtikelen van de Concentratie

Eiwit Concentratie

Het eiwit Protocol van de Concentratie

De EiwitAnalyse van Lowry

Het Protocol van de Methode van Lowry

De Methode van Bradford

Andere EiwitMethodes:

Westelijke Vlek

Immunoprecipitation