Bio-informatica, Protocollen, RNA EiwitProteomics van DNA

huis > eiwit-microarrays-eiwit > eiwit-spaander-opsporing > index.php

De eiwit Protocollen van de Serie	De eiwit Bio-informatica van de Serie	Leer over EiwitSeries	De de eiwit Uitrustingen en Producten van de Serie	Het eiwit Forum van de Serie	Het Nieuws van Proteomic

De eiwit Methodes van de Opsporing Microarray en Analyse

Proteïne en Antilichaam Microarrays

De Methodes van de opsporing en Analyse voor de Spaanders van de Proteïne en van het Antilichaam

 

De Methodes van de opsporing en Niet-specifieke Band
            De niet-specifieke band aan de serie moet worden geminimaliseerd en dit wordt typisch gedaan door de series in een runderserumalbumine gebaseerde buffer (BSA) onder te dompelen (31).
            De analyte-band en het behoud op eiwitseries gaan via thermodynamisch gedreven bandmechanisme gelijkend te werk op de kruising van nucleic zuurdoelstellingen aan sondes.  Nochtans, is de opsporing van verbindende doelstellingen aan proteïnen aanzienlijk complexer dan dat van microarray opsporing van DNA (9).  Momenteel worden een verscheidenheid van opsporingsmethodes onderzocht.  Bijvoorbeeld, werd ELISA eerst gebruikt om proteïnen voor zowel filterseries (66.67) en glasseries (68) te ontdekken.  De ELISA gebaseerde opsporingsmethodes hebben het nadeel van niet-specificiteit van eiwit-antilichameninteractie, die tot vele valse positieven leiden.   Etikettering van de radio-isotoop werd et al gebruikt door Duitsland. (22), radio-isotoop etikettering aan studie eiwit-proteïne, eiwit-DNA, eiwit-druginteractie op filterseries.  Zhu et al. gebruikte radio-isotoop etikettering om kinaseanalyses van verschillende substraten te leiden door de gezuiverde proteïnen van het gistkinase op een serie (36) te gebruiken.  De aangewezen methode van opsporing is fluorescentieopsporing omdat deze methodes over het algemeen veilig zijn, uiterst gevoelig, eenvoudig en zeer hoge resolutie kunnen hebben.  Deze opsporingsmethodes zijn ook compatibel met standaard microarray scanners. Over het algemeen, is een spaander één van beiden direct gesondeerd met een fluorescente molecule (b.v. een fluorescently geëtiketteerded eiwit of kleine molecule, door een geëtiketteerdec sonde (b.v. biotine) te gebruiken, die dan in een tweede stap kan worden ontdekt gebruikend een fluorescently geëtiketteerdej affiniteitreagens (b.v. streptavidin) (16.56). Een andere fluorescente etiketteringsmethode rolt cirkelversterking (RCA), die ook uiterst gevoelig is (32).  
            Hoewel proteomes onder vergelijking op een vergelijkbare manier met fluorophores kunnen worden geëtiketteerdb, is de reproduceerbaarheid van deze chemische reacties slecht en de interferentie met de eiwit-antilichameninteractie stelt een extra ingewikkeldheid (9) voor. Ook, kan de niet-uniforme etikettering van proteïnen worden gericht door een dubbel-kleuren ratiometric analyse uit te voeren, waar een interne norm voor elke doelproteïne aanwezig is die (9) wordt gemeten.          Een nadeel van de etikettering van proteïnen met fluorophores is een vermindering van de kwantitatieve nauwkeurigheid van de analyse, aangezien de integratie van het etiket de bindende eigenschappen van proteïnen (9) kan veranderen.

Hoewel de directe eiwitmethodes van de etiketteringsopsporing nog wijd worden gebruikt, heeft de intrinsieke vermelde problemen in het stijgende gebruik van methodes van de etiket de vrije opsporing voor proteïne microarrays geresulteerd.  Deze methodes zijn massaspectrometrie (lidstaten), de atoomkrachtmicroscopie (AFM) (70), en oppervlakteplasmon resonantie (SPR) (71). 
Niet-etiketteert de methodes hebben voordelen als directe opsporingsbenadering voor antilichaam microarrays aangezien de etikettering van molecules eiwitactiviteit beïnvloedt. SELDI (oppervlakte-verbeterde laserdesorptie/ionisatie) de massaspectrometrie is gebruikt om series met geringe dichtheid van gevangen proteïnen (69) te ontdekken. De proteïnen worden gevangen op een serie van de metaaloppervlakte (eiwitserie SELDI) en zijn vapourized het gebruiken van een laserstraal.  De analyse die de gegevens van de massaspectrometrie gebruikt wordt dan uitgevoerd om de identiteiten van deze proteïnen te openbaren.

            Methode de atoom van de krachtmicroscopie (AFM) gebruikt oppervlakte topologische veranderingen om de gevangen proteïnen op een antilichamenserie (70) te identificeren.  Wanneer het konijn IgG op een gouden oppervlakte wordt geïmmobiliseerd en aan zijn vleiende antilichamen bindt, ontdekt het geit mier-konijn IgG, AFM de verhoging van hoogte, en kan zo bindende interactie meten.  Nochtans om de kinetica van antigeen-antilichaam interactie te bestuderen, zullen de opsporingsmethodes in real time nuttig zijn.  Plasmon van de oppervlakte de resonantie (SPR) heeft in een veelzijdig opsporingshulpmiddel gerijpt om de kinetica van receptor -receptor-ligandinteractie met een brede waaier van molecuulgewichten, affiniteiten en bindende tarieven (72-74) te bestuderen. De commerciële spaanders SPR zijn beschikbaar nochtans is hun opsporingsresolutie beperkt.  Een sensoroppervlakte met 64 individuele immobilisatieplaatsen in werd één enkele stroomcel ontwikkeld (75).  Biosensor van de antilichamenserie werd ook ontwikkeld om de kinetica van antigeen te bestuderen dat gebruikend een vlakgolfgeleider als opsporingsmethode bindt. Gebruikend deze methode, toonde de groep aan dat de significante signaalintensiteit van vlekken zo zou kunnen worden bereikt klein zoals 200 mm in diameter. Men verwacht daarom dat deze benadering voor hoog-productie en parallelle kineticastudies geschikt zal zijn. (76).

Waaier van Opsporing
            Een ander verschil tussen proteïne en DNA microarrays is dat de eiwitconcentraties in één enkele biologische steekproef of de cellen verscheidene orden van magnitute groter dan dat voor mRNAs zijn.  Aldus moeten de eiwitsystemen van de spaanderdetector een zeer grote waaier van opsporing verrichting - tot een factor van 1014 hebben, in vergelijking met 104 voor mRNA.  Aldus zal een antilichaam met nanomolar affiniteit aan een bepaald doel door de aanwezigheid van dit doel bij micromolar concentraties worden verzadigd en zal er niet in slagen om pico- of femtomolar doelniveaus te ontdekken.  Aldus het aanpassen zullen de zeldzame en overvloedige proteïnen waarschijnlijk afzonderlijke series vereisen (7.8.9).
            De veelvoudige antilichamen met variërende affiniteiten voor het doel kunnen bij verschillende gebieden van de serie worden geplaatst nochtans hebben de studies aangetoond dat slechts 20% van opgestelde antilichamen metingen van proteïnen bij lage concentraties verstrekken (33). 

 

 

Daarna: Eiwit Productie voor EiwitSeries

Verwijzingen voor Proteïne en Antilichaam Microarrays

Terug naar:

Inleiding en Achtergrond van EiwitSpaanders en de Spaanders van het Antilichaam.

Types van Antilichaam en EiwitSpaanders