Onthaal aan Moleculaire Post!

U moet registreren alvorens u op onze forums kunt posten of onze geavanceerde eigenschappen gebruiken. Register nu! Zijn Vrij en Snel!

Reeds geregistreerd? Login nu hieronder.

De Naam van de gebruiker:

Wachtwoord:

Herinner me?

Vergat reeds geregistreerd en uw wachtwoord? Klik hieronder om het terug te krijgen.

Krijg Verloren Wachtwoord terug

Treed nu toe - het is snel en vrij!

De moleculaire Post is overal het grootste netwerk van onderzoekers, wetenschappers en wetenschapsminnaars!

De recente Posten van het Forum

PCR Protocollen Â	PCR Bio-informatica en Gegevensbestanden	Leer over PCR	PCR Uitrustingen en Producten	PCR Forum	PCR Boeken Â

Succesvolle PCR Voorwaarden

 

Parameters voor Succesvolle PCR

Wordt u gehad problemen om succesvolle PCR te bereiken?  Vele factoren kunnen uw resultaat van uw PCR zoals beïnvloeden: De IonenCofactoren van het metaal, Substraat en de Analogons van het Substraat, Buffers en Zouten en Cosolvents.  Ook Thermische het Cirkelen Overwegingen:  PCR Schepen, de Optimalisering van de Temperatuur en van de Tijd, PCR de Cycli van de Versterking, Enzym/Doel en Heet Begin. 

De IonenCofactoren van het metaal en PCR

Een essentiële cofactor voor de polymerase van DNA in PCR is het chloride van het Magnesium.  Zijn concentratie moet voor elke inleiding worden geoptimaliseerd: malplaatje systeem. Vele componenten van de reactie binden magnesiumion, met inbegrip van inleidingen, malplaatje, PCR producten en dNTPs. Het belangrijkste 1:1 bindmiddel voor magnesiumion is de hoge concentratie van dNTPs in de reactie. Omdat het voor vrij magnesiumion om als enzymcofactor in PCR noodzakelijk is te dienen, moet de totale magnesium ionenconcentratie de totale dNTPconcentratie overschrijden. Typisch, om het optimaliseringsproces te beginnen, wordt 1.5 van het magnesiummm chloride toegevoegd aan PCR in aanwezigheid van 0.8 mm totale dNTPs. Dit verlaat ongeveer 0.7 mm vrij magnesium voor de polymerase van DNA. In het algemeen, zou het magnesiumion in een concentratiereeks van 1.5-4.0 mm in 0.5 mmstappen moeten worden gevariÃërd.

Substraten en de Analogons van het Substraat voor PCR

De polymerase van DNA nemen zeer efficiënt op dNTPs.  Zij kunnen ook gewijzigde substraten opnemen, wanneer zij als supplementaire componenten in PCR worden gebruikt. De voorbeelden van substraten die voor de polymerase van DNA worden gebruikt zijn: Digoxigenin -digoxigenin-dUTP, biotine -biotine-11-dUTP, dUTP, c7deaza-dGTP, en fluorescently geëtiketteerdk dNTPs. Voor conventionele PCR, blijft de concentratie van dNTPs evenwichtig in equimolar verhoudingen, b.v., 200 μM elke dNTP. Merk ook op dat, de afwijkingen van deze standaardaanbevelingen in bepaalde amplications voordelig kunnen zijn. Bijvoorbeeld, wanneer de willekeurige mutagenese van een specifiek doel wordt gewenst, bevorderen de uit zijn evenwicht gebrachte dNTP concentraties een hogere graad misincorporations door de polymerase van DNA.

Buffers en Zouten voor PCR

Afhankelijk van DNA gebruikte de polymerase de optimale PCR bufferconcentratie, zoute concentratie, en pH zou dienovereenkomstig aan de polymerase van DNA moeten worden geplukt. De PCR buffer voor de polymerase van DNA Taq bestaat uit 50 mm KCl en 10 mm tris-HCl, pH 8.3, bij kamertemperatuur. Deze buffer verstrekt de Ionische sterkte en de buffercapaciteit nodig tijdens de reactie. Het is belangrijk om op te merken dat de zoute concentratie Tm van de inleiding beïnvloedt: malplaatje duplex, en vandaar de onthardende temperatuur.

Cosolvents

Verschillende PCR Cosolvents wordt gebruikt om de opbrengst, de doeltreffendheid, en de specificiteit van PCR versterking te verhogen. Deze cosolvents kunnen in sommige versterking in andere versterking voordelig, en nadelig zijn. Het is onmogelijk om te voorspellen welk additief voor elke inleiding nuttig zal zijn: de malplaatje duplex en daarom cosolvent moet empirisch voor elke combinatie worden getest.

Thermische het Cirkelen Overwegingen

PCR Schepen

PCR moet in schepen worden uitgevoerd die met lage hoeveelheden enzym en nucleic zuren compatibel zijn en die goede thermische overdrachtkenmerken hebben. Gewoonlijk, wordt het polypropyleen gebruikt voor PCR schepen en de conventionele, thick-walled microcentrifugebuizen worden gekozen voor vele thermische cyclersystemen. PCR wordt het vaakst uitgevoerd bij een 10-100 μL reactieschaal en vereist de preventie van de verdamping/condensatieprocessen in de gesloten reactiebuis tijdens het thermische cirkelen. Een van de minerale oliebekleding of was laag dient dit doel. Meer onlangs, zijn thin-walled schepen 0.2-ml geoptimaliseerd voor het PCR proces en olievrije thermische cyclers zijn ontworpen die een verwarmde dekking over de buizen gebruiken die binnen het steekproefblok worden gehouden.

De Optimalisering van de temperatuur en van de Tijd van de Cyclus

Het is essentieel dat de reactiemengsels de denaturatie, het ontharden, en de uitbreidingstemperaturen in elke thermische cyclus bereiken. Als de ontoereikende greeptijd bij om het even welke temperatuur wordt gespecificeerd, zal de temperatuur van de steekproef niet in evenwicht gebracht worden met dat van het steekproefblok. Wat thermische cycler ontwerpt tijd het greepinterval dat op de bloktemperatuur wordt gebaseerd, terwijl anderen de greeptijd op voorspelde steekproeftemperatuur baseren. Als een conventionele thick-walled buis in een cycler gebruikte die door bloktemperatuur wordt gecontroleerd, volstaat een tijd van de jaren '60greep voor evenwicht. De extra tijd kan bij de stap (van de 72°C) uitbreiding voor langere PCR producten worden geadviseerd. Gebruikend een thin-walled buis 0.2-ml in een cycler die door voorspelde steekproeftemperatuur wordt gecontroleerd, worden slechts 15 s vereist. Om bestaande protocollen of aan ontwikkelingsprotocollen voor gebruik bij veelvoudige laboratoria te gebruiken, is het zeer belangrijk om greeptijden volgens het cyclerontwerp en de dikte van de buismuur te kiezen.

PCR het Aantal van de Cyclus van de Versterking

Het aantal PCR versterkingscycli met betrekking tot de beginnende concentratie van doelDNA moeten zou worden geoptimaliseerd. Men adviseert dat, van 40 - 45 cycli om 50 doelmolecules te vergroten, en 25-30 cycli om 3 molecules × 105 aan de zelfde concentratie te vergroten. Deze niet-evenredigheid wordt veroorzaakt door een zogenaamd plateaueffect, waarin een daling van het exponentiële tarief van productaccumulatie in recente stadia van PCR voorkomt. Dit kan door degradatie van reactanten (dNTPs, enzym) worden veroorzaakt; reactant uitputting (inleidingen, dNTPs); eindproduct remming (pyrofosfaatvorming); de concurrentie voor reactanten door niet-specifieke producten; of de concurrentie voor inleiding het binden door van geconcentreerd (10 NM) product reannealing. Het is gewoonlijk raadzaam om het minimumaantal cycli in werking te stellen nodig om het gewenste specifieke product te zien, omdat de ongewenste niet-specifieke producten zich zullen mengen als het aantal cycli bovenmatig is.

 Enzym/Doel

In een standaardgedeelte van de polymerase van DNA Taq die voor een reactie 100 wordt gebruikt μL, zijn er ongeveer 1010 molecules. Elke PCR steekproef zou voor het aantal doelexemplaren moeten worden geëvalueerdb het bevat of kan bevatten. Bijvoorbeeld, 1 bevat ng van lambdaDNA 1.8 exemplaren × 107. Voor het aantalPCR van het laag-inputexemplaar, wordt het enzym beperkend en het kan noodzakelijk zijn om het uitbreidingsproces meer tijd oplopend te geven. Thermische cyclers kunnen deze automatische procedure van de segmentuitbreiding betrouwbaar uitvoeren om PCR opbrengst te maximaliseren.

De hete Voorwaarden van het Begin

Alle bovengenoemde optimalisering zijn ook op PCR van toepassing die, van bij het begin, met een hete beginmethode wordt ontworpen. Vaak, kan een heet begin met succes in eerder geoptimaliseerde PCR worden opgenomen zonder de reactievoorwaarden te veranderen. Nochtans, betaalt het gewoonlijk aan reoptimize na het toevoegen van een heet begin. De optimalisering is vaak een evenwicht tussen het produceren van zoveel mogelijk product en niet-specifieke overproductie, achtergrondversterking. Omdat het hete begin zeer achtergrondversterking vermindert, wordt de hogere terughoudendheid opgeheven op voorwaarden zoals enzymconcentratie, cyclusaantal, en concentratie van de metaal de ionencofactor. Gevoelige PCRs dat hoogst zonder een heet begin is gestemd kan ontbreken wanneer een heet begin wordt toegevoegd. Dit kan door lichte vertragingen in vroege cycli worden veroorzaakt die door zich het mengen of enzymactivering worden veroorzaakt. PCR kan gewoonlijk, vaak met wezenlijke verhoging van specifiek product worden hersteld, door eenvoudig te stijgen beperkend parameters of reagentia. Bovendien zijn er optimalisering specifiek voor elke hete beginmethode. Het mengen zich of de enzymactivering kan door PCR volume, buffersamenstelling en pH worden beïnvloed, cosolvents, het cirkelen voorwaarden, etc. De literatuur van het specifieke product, vaak een producttussenvoegsel, zou voor informatie moeten worden geraadpleegd over deze overwegingen.