Geschiedenis en Ontwikkeling van de Kettingreactie van de Polymerase (PCR)

            Meer dan 30 jaar geleden, hervormde de introductie van de recombinante technologie van DNA als hulpmiddel voor de biologische wetenschappen de studie van het leven.  Het moleculaire klonen stond de studie van individuele genen van het leven organismen toe; nochtans was deze techniek afhankelijk bij het verkrijgen van een vrij grote hoeveelheid zuivere DNA.  Dit hing van de replicatie van DNA van plasmiden of andere vectoren af tijdens celafdeling van micro-organismen (1).  De onderzoekers vonden het afmattend en moeilijk uiterst om een specifieke DNA in hoeveelheid uit de massa van genen te verkrijgen huidig in een biologische steekproef (2).   De recombinante technologie van DNA maakte de eerste moleculaire analyse en de prenatale diagnose van verscheidene menselijke ziekten mogelijk.  Foetale DNA die door amniocentesis bemonstering wordt verkregen zou door de spijsvertering van het beperkingsenzym, elektroforese, zuidelijke overdracht en kruising aan een gekloond gen of oligonucleotide sondes (3) kunnen worden geanalyseerd.  Nochtans, het zuidelijke liet bevlekken slechts rudimentaire afbeelding van genen in niet verwante individuen (4) toe. 

PCR, een acroniem voor de Kettingreactie van de Polymerase (5.6), stond de productie van grote hoeveelheden een specifieke DNA van een complex malplaatje van DNA in een eenvoudige enzymatische reactie toe.  PCR is een onlangs ontwikkelde procedure voor de versterking in vitro van DNA.  PCR heeft de manier omgezet dat bijna alle studies die de manipulatie van de fragmenten van DNA vereisen als resultaten van zijn eenvoud en nut (7) kunnen worden uitgevoerd. 
In de jaren '80, Kary Mullis (Figuur 1) en een team van onderzoekers bij Bedrijf Cetus bij Bedrijf Cetus opgevat van een manier om de actie van een polymerase te beginnen en tegen te houden op specifieke punten langs één enkele bundel van DNA.  Mullis realiseerde ook dat door deze component van moleculaire reproductietechnologie uit te rusten, doelDNA exponentieel zou kunnen worden vergroot.  Deze de versterkingsprocedure werd van DNA gebaseerd op in vitro eerder dan een levend proces (5.6.8).  Versterking de zonder cellen van DNA door PCR kon veel van de standaardprocedures vereenvoudigen om, nucleic zuren (1) te klonen te analyseren en te wijzigen.  De vorige technieken om een specifiek stuk van DNA te isoleren baseerden zich bij gen het klonen - een vervelende en langzame procedure.  PCR, enerzijds Kerry verklaarde Mullis „laat u het stuk van DNA plukken u geinteresseerd in bent en zo veel van het hebt aangezien u“ wilt (2.8).   Toen andere wetenschappers Cetus uiteindelijk in het maken van de polymerasekettingreactie presteren zoals die op een betrouwbare manier wordt gewenst slaagden, hadden zij een immensely krachtige techniek om onbeperkte hoeveelheden de nauwkeurige genetische materiële moleculaire biologen en vereiste anderen voor hun werk (8) hoofdzakelijk te verstrekken.  Sinds het eerste rapport in1985, werden meer dan 5000 wetenschappelijke documenten gepubliceerd tegen 1992 (1).  Voorts het grote aantal publicaties het onmogelijk natuurlijk maakt om alle belangrijke bijdragen tot de ontwikkeling en de toepassing van PCR technologie te herzien; nochtans zullen wij proberen om de belangrijkste ontwikkelingen in de praktijk van basisPCR hier te herzien. 

PCR werd verondersteld om door Dr. Kerry Mullis in 1983 worden opgevat terwijl het werken bij het Bedrijf Cetus in Emeryville, CA.  Nochtans, werd wat bereidend werk ook gedaan door Gobind Khorana in 1971 wie een basisprincipe beschreef om een stuk van DNA te herhalen gebruikend twee inleidingen.  De vooruitgang werd toen beperkt door van de inleidingssynthese en polymerase reinigingskwesties (9).   In het hoofd van Mullis, groeide de uitvinding van een theoretische regeling om het beperkte dideoxynucleotide rangschikken van unieke menselijke genen uit te voeren gebruikend synthetische oligonucleotides voor het diagnostiseren van gemeenschappelijke menselijke ziekteveranderingen.  Een duidelijke hindernis voor zulk een directe het rangschikken strategie was de hoge ingewikkeldheid van het menselijke genoom (3.3 X 109 basisparen).  Aldus, tweede werd oligonucleotide of een inleiding toegevoegd om de vooruitgang van de synthese van de eerste inleiding te blokkeren.   Later nochtans, was deze tweede inleiding inbegrepen om aan de andere bundel van DNA te binden, zodat elke bundel van mutantallele zou bijdragen tot het uiteindelijke signaal.  Als de regeling die gelijktijdige kruising van inleidingen impliceert aan elke bundel door het mengsel te verwarmen en dan de het ontharden en uitbreidingsstappen te herhalen werd gewijzigd, dan het primaire signaal nog verder worden verhoogd.  Het herhalen van de stappen zou toelaten dat de producten van de eerste ronde worden gedupliceerd in de tweede cyclus, om twee exemplaren op te brengen.  Het herhalen van de cyclus zou opnieuw in vier exemplaren, enz. resulteren.  Verscheidene weken die vóór dit grote idee worden overgegaan werden geprobeerd (8).  Twee inleidingen waren samengesteld volkomen complementair om aan elk eind van het gebied van het 110 basispaar van een gekloond segment van menselijke het B-globin gen te zijn, werd de versterking uitgevoerd, en de producten werden geïdentificeerdr door acrylamide gelelektroforese.  Het eindresultaat was het voorzien fragment van DNA van het 110 basispaar en het begin van PCR als basistechniek in moleculaire biologie (5.6).
In origineel PCR van Mullis proces (5.6.8), werd het enzym in vitro gebruikt (in een gecontroleerd milieu buiten een organisme).  Double-stranded DNA werd gescheiden in twee enige bundels door het aan 96°C. te verwarmen.  Bij deze temperatuur, echter, werd de polymerase van DNA E.Coli vernietigd zodat het enzym na het het verwarmen stadium van elke cyclus moest worden bijgevuld.  Was het originele PCR van Mullis proces zeer inefficiënt aangezien het heel wat tijd, enorme hoeveelheden DNA-Polymerase, en voortdurende aandacht door het PCR proces vereiste.

            Het onderzoek van het PCR versterkingsmechanisme openbaart zijn eenvoud maar ook zijn elegantie (Figuur 2).  Oligonucleotide de inleidingen worden eerst ontworpen complementair om aan de einden van de opeenvolging te zijn te vergroten en, dan in maalovermaat met het malplaatje van DNA moet worden gemengd en deoxyribonucleotides in een aangewezen buffer.  Na het verwarmen om de originele bundels te denatureren en het koelen om inleiding het ontharden te bevorderen, binden oligonucleotides elk aan een verschillende bundel van het doelfragment.  De inleidingen worden geplaatst zodat wanneer elk door de actie van een polymerase van DNA wordt uitgebreid, de onlangs samengestelde bundels de bandplaats van tegenovergestelde oligonucleotide zullen overlappen.  Aangezien het proces van denaturatie, het ontharden, en polymeraseuitbreiding wordt voortgezet binden de inleidingen herhaaldelijk aan zowel het originele malplaatje van DNA als bijkomende plaatsen in de onlangs samengestelde bundels en uitgebreid om nieuwe exemplaren van DNA (Figuur 3) te veroorzaken.  Het eindresultaat is een exponentiële verhoging van het totale aantal fragmenten van DNA die de opeenvolgingen tussen de PCR inleidingen omvatten, die definitief bij een theoretische overvloed van 2n worden vertegenwoordigd, waar n het aantal cycli is (1.7.13).

Een polymerase van DNA is a natuurlijk - het voorkomen enzym, een biologische macromolecule die de vorming en de reparatie van DNA katalyseert. Het werkt door aan één enkele bundel van DNA te binden en een bijkomende bundel te creëren.  De nauwkeurige replicatie van al het leven kwestie hangt van deze activiteit af, waar het functioneert om DNA te dupliceren wanneer de cellen verdelen (10.11).  Hebben onlangs slechts wetenschappers leerde om deze activiteit te manipuleren en het toe te passen op wetenschappelijk onderzoek.  De vroegste PCR experimenten utlilized het fragment Klenow van polymerase I van DNA van Escherichia coli bij een temperatuur van 37C om specifieke doelstellingen van menselijke genomic DNA (5.6) te vergroten.  Vaak produceerden deze PCR reacties onvolledig zuiver doelproduct zoals die door gelelektroforese (1) wordt geoordeeld.  Deze aanvankelijke PCR versterking met het fragment Klenow was niet hoogst specifiek (5.6).  Hoewel een uniek fragment van DNA vergrote vouwen ~200,000 van genomic DNA zou kunnen zijn, was slechts ongeveer 1% van het PCR product de gerichte opeenvolging (13).  Een specifieke kruisingssonde werd vereist om vergrote DNA (5.6) te analyseren.  
Sommige PCR voorwaarden werden bepaald om de starheid van inleidingskruising zoals lagere MgCl2 concentraties en hogere onthardende temperaturen te verhogen.
Voorts de concentratie van enzym en inleidingen, de onthardende tijd, uitbreidingstijd, en aantal van PCR werden de cycli allen gevonden om de specificiteit van PCR uit te voeren.
Ook, kan de concentratie van een specifieke opeenvolging in een steekproef de relatieve homogeniteit van de PCR producten (1.7.13.14.15) ook beïnvloeden.   De trifosfaat en het magnesium van Deoxyribonucleotide in een aangewezen buffer zijn ook belangrijke ingrediënten voor PCR.  De efficiency en de specificiteit van PCRs kunnen door variaties in de concentratie en de verhouding van vrij magnesium, deoxyribonucleotidetrifosfaat, en inleidingen worden beïnvloed.  Deze reagentia moeten worden geoptimaliseerd om hoge specificiteit en opbrengst (14) te bereiken.  Men ontdekte ook dat het effect van temperatuur en oligonucleotide inleidingslengte op de specificiteit en efficiency van versterking door de polymerasekettingreactie (15).
De inactivering van het fragment Klenow van polymerase I van DNA van Escherichia coli bij op hoge temperatuur vereist voor bundelscheiding vereiste de toevoeging van enzym na de denaturatiestap van elke cyclus (5.6).  Voorafgaand aan 1988, werd iedereen die een PCR reactieprocedure leidt verplicht om geduldig te zitten door een reeks waterbaden of het verwarmen blokken en een vers gedeelte van de polymerase van DNA E.Coli na elke denaturatiestap toe te voegen, die typisch door het reactieschip in kokend water voor ½ een minuut aan 3 minuten (7) onder te dompelen werd uitgevoerd.   Deze eerder vervelende stap werd eens overbodig gemaakt door de introductie van een thermostable polymerase van DNA, de polymerase van DNA Taq (12), aan het begin van de PCR reactie.  De thermostable eigenschappen van de de polymeraseactiviteit van DNA werden geïsoleerd(van aquaticus Thermus (Taq) (Figuur 4) dat in geisers van over 110C groeit, heeft en zeer bijgedragen tot de opbrengst, de specificiteit, de automatisering, en het nut van de polymerasekettingreactie (1.7.12).   Het enzym Taq kan het herhaalde verwarmen aan 94C weerstaan en zo telkens als het mengsel wordt gekoeld om de oligonucleotide inleidingen toe te staan om de katalysator voor de uitbreiding te binden is reeds aanwezig (1.7).  Nochtans, werden de hogere onthardende temperaturen niet duidelijk gemaakt tot de enige „belangrijkste ontwikkeling van PCR ontwikkeling“ (8), de reiniging en de commerciële distributie van een hittebestendige polymerase van DNA van thermophilic aquaticus van bacterieThermus (Taq) (12). 
De isolatie van een hittebestendige polymerase van DNA liet inleidings het ontharden en uitbreiding om bij opgeheven temperaturen (1.7.12.13) worden uitgevoerd, daardoor ook het verminderen van het slecht gecombineerde ontharden tot nontargetopeenvolgingen (niet-specifieke versterking) of het verhogen van specificiteit toe.   Op deze wijze, voor vele versterking zou het PCR product als één enkele ethidium bromide-bevlekte band op een elektroforetisch gel (12) kunnen worden ontdekt.  Deze verhoogde specificiteit verhoogde ook de opbrengst van DNA van de doelopeenvolging.  Voorts zouden de langere PCR producten van genomic DNA, waarschijnlijk kunnen worden vergroot wegens een vermindering van de secundaire structuur van de malplaatjebundels bij de opgeheven temperatuur die voor inleidingsuitbreiding wordt gebruikt.  De hogere groottegrens voor Klenow de versterking van de fragmentpolymerase was slechts over 400bp.  De polymerase van Taq en andere thermostable polymerase hebben fragmenten tot 10 kb samengesteld (1.7.12.13).  De beschikbaarheid van polymerase Taq heeft ook zeer de automatisering van de reactie vereenvoudigd aangezien het een veel gemakkelijkere taak is om een apparaat te construeren dat een reactiebuis door verschillende temperaturen dan zal cirkelen om een apparaat te vervaardigen dat zowel het thermocycling als de toevoeging van enzymgedeelten zou uitvoeren.  Momenteel is er een grote verscheidenheid van commercieel beschikbare thermocyclers.  Deze ontwikkeling is een significante factor in de snelle toepassing van deze technologie door wetenschappelijke gemeenschap (7) geweest. 

            Naast de productie van double-stranded, bot-gebeëindigde fragmenten van DNA die door PCR kunnen worden gevormd, dragen twee andere eigenschappen van de PCR regeling zeer tot het nut van PCR bij.  Eerst, bepaalt de positie van band van de inleidingen de grenzen van het vergrote fragment en daarom wordt het vroegere moleculaire het klonen vereiste van beperkingsendonuclease erkenningsplaatsen niet vereist voor PCR.  Aangezien slechts een beperkt aantal opeenvolgingen van DNA beperkingsplaatsen is, verhoogt PCR zeer de flexibiliteit van keus van fragmentgrootte en samenstelling.  Ten tweede, is het niet noodzakelijk voor PCR oligonucleotides precies complementair aan malplaatjeDNA te zijn.  De „staarten“ kunnen aan' worden toegevoegd eind 5 van de inleiding om opeenvolgingen binnen de instructieplaatsen te introduceren die zo kunnen worden geëxploiteerde om beperkingsendonuclease erkenningsplaatsen of andere nuttige opeenvolgingen zoals veranderingen in vergrote DNA te introduceren.  Deze fenomenen stonden de totstandkoming van PCR als methode toe voor het snelle klonen van DNA (1.7.13).

Het moleculaire klonen heeft van de totstandkoming van PCR als techniek geprofiteerd.  Het directe klonen werd eerst geleid gebruikend een 110 bp fragment van DNA vergroot door PCR en oligonucleotide inleidingen die beperkingsendonuclease erkenningsplaatsen bevatten die aan hun 5' einden worden toegevoegd.  Deze plaatsen werden gebruikt om het klonen van vergrote DNA in een M13 plasmide (17) te vergemakkelijken.  Het 110 bp fragment werd ook gerangschikt om te bevestigen dat deze benadering een snelle maar toch betrouwbare benadering was van het klonen.  (Figuur 5)

Hetgebaseerde klonen van DNA impliceert de replicatie van DNA in vivo, die met een zeer hoge trouw van het kopiëren wegens het corrigeren mechanismen wordt geassociÃërd.  Nochtans, wanneer DNA in vitro zoals met PCR wordt herhaald, is het het kopiëren foutentarief aanzienlijk groter.  De wijdst gebruikte polymerase, de polymerase van DNA Taq nochtans, heeft geen bijbehorende exonuclease 3' aan 5' om een het corrigeren functie te verlenen.  Aldus is het foutentarief toe te schrijven aan basismisincorporation tijdens de replicatie van DNA eerder hoog voor Taq: voor a1kb opeenvolging die 20 efficiënte cycli van verdubbeling heeft ondergaan, zal ongeveer 40% van de nieuwe bundels van DNA die door PCR worden samengesteld die dit enzym gebruikt een onjuist nucleotide als gevolg van een het kopiëren fout bevatten (16).  Daarom zelfs als de PCR reactie versterking van één enkele opeenvolging van DNA impliceert, zal het definitieve product een mengsel van bijna aanpassing, maar de niet identieke opeenvolgingen van DNA zijn.  Ondanks de fouten toe te schrijven aan replicatie in vitro, kan het rangschikken van DNA van het totale PCR product de correcte opeenvolging geven toe te schrijven aan het feit dat de integratie van onjuiste basissen hoofdzakelijk willekeurig is en de bijdrage van één onjuiste basis op één of meerdere bundels door de bijdragen van de reusachtige meerderheid van bundels wordt overweldigd die de correcte opeenvolging zal hebben.  Nochtans, als het PCR product in cellen moet worden gekloond, kunnen verscheidene individuele klonen moeten worden gerangschikt om de correcte (consensus) opeenvolging te bepalen, voorafgaand aan het leiden van verdere experimenten.
Meer onlangs, is het probleem van infidelity van de replicatie van DNA tijdens de PCR reactie aanzienlijk verminderd door de alternatieve heat-stable polymerase van DNA te gebruiken die 3' aan 5' exonucleaseactiviteit hebben geassociÃërd.  De polymerase en Thermococcus Litoralis van furiosus (Pfu) DNA van Pyrococcus (OPENING) worden die wijder wegens corrigeren worden gebruikt verleend door hun bijbehorende 3' aan 5' exonucleaseactiviteit (18).  Het resulterende PCR product van Pfu bijvoorbeeld, heeft een veel lager niveau van veranderingen die door fouten worden geïntroduceerd te kopiëren: voor a1kb segment van DNA dat 20 efficiënte cycli van verdubbeling heeft ondergaan, loopt ongeveer 3.5% van DNA in het product vast draagt een veranderde basis (16).

De nieuwe benaderingen zijn om specificiteit te verbeteren ontwikkeld gebaseerd op de erkenning dat de polymerase van DNA Taq aanzienlijke enzymatische activiteit goed bij temperaturen onder het optimum voor de synthese van DNA behoudt.  Aldus, kunnen ontharden de inleidingen die niet-specifiek aan gedeeltelijk één enkel vastgelopen malplaatjegebied worden uitgebreid alvorens de reactie 72°C voor uitbreiding van specifiek ontharde inleidingen bereikt.  Als de polymerase van DNA wordt geactiveerd slechts nadat de reactie hoge (>70°C) temperaturen heeft bereikt, kan de niet-doelversterking worden geminimaliseerd (19.20).  Deze „Heet begin“ benadering kan door handtoevoeging van een essentiële reagens worden verwezenlijkt van de selectiebuis bij opgeheven temperaturen.  De toevoeging van ssDNA bindende proteïne is ook gemeld om specifieke versterking te verhogen.  Een meer gebruikersvriendelijke benadering is of remming of inactivering van de polymerase van DNA zelf te gebruiken.  Twee soorten remming van de polymerase van DNA zijn Taq geprobeerd met inbegrip van oligonucleotide remming (21) en antilichamen (22) remming. De hoogst specifieke oligonucleotide inhibitors van beide polymerase van DNA zijn Taq geproduceerd.  Deze remmen selectief de polymeraseactiviteit van DNA bij temperaturen onder 40°C en om in de Hete toepassingen van het Begin getoond te functioneren.  Alternatief, kan men een antilichaam tegen de polymerase van DNA gebruiken Taq. Het antilichaam verbiedt de polymerase van DNA tot de temperatuur van PCR is dusdanig dat het antilichaam bij een temperatuur groter dan 55°C wordt gedenatureerd, daardoor vrijgevend het enzym.  Nochtans zijn er nadelen aan dit type van de Hete voorwaarden van het Begin.  In dit geval, vergt men een antilichaam voor elk verschillend enzym dat in PCR wordt gebruikt en voor een groot aantal van PCRs kan dit kosten beduidend toenemen.  De geschiktste vorm van Heet Begin moet de polymerase van DNA wijzigen zodanig dat het bij kamertemperatuur (temperatuur-gevoelige mutant) inactief is, en na incubatie bij 95°C 6-15 minuten slechts gereactiveerd (23).  

Wegens zijn eenvoud, is PCR een populaire techniek met een brede waaier van toepassingen
met inbegrip van het directe rangschikken, het genomic klonen, het typen van DNA, opsporing van besmettelijke micro-organismen, plaats-geleide mutagenese, prenataal genetisch ziekteonderzoek, en analyse van allelic opeenvolgingsvariaties (1.7.13.16) die van hoofdzakelijk drie belangrijke voordelen van de methode afhangen:

Snelheid en handigheid:   Het klonen van DNA door PCR kan in een vrij korte hoeveelheid tijd, binnen een paar uren worden uitgevoerd.  Gewoonlijk, bestaat een PCR reactie uit rond 30 cycli elke cyclus die een denaturatie, synthese bevat en stap, met een individuele cyclus reannealing die typisch 3 5min in een geautomatiseerde thermische cycler neemt.  Dit is duidelijk sneller dan de tijd die voor hetgebaseerde klonen van DNA wordt vereist, die weken van tijd kon vergen.  Voorts is het vrij gemakkelijk aan opstelling een PCR reactie en het gebruik van een thermocyclermachine is ook gemakkelijk.  Wat tijd wordt vereist voor het ontwerp en de synthese van oligonucleotide inleidingen, maar dit is vereenvoudigd door de beschikbaarheid van computersoftware voor inleidingsontwerp en snelle commerciële of academische synthese van douaneoligonucleotides.   De optimalisering van PCR voorwaarden kan zoals inleidings onthardende temperatuur, magnesiumconcentratie, en inleidingsconcentratie worden vereist.  Nochtans, is de verwezenlijking van gradiëntPCR machines die een verscheidenheid van inleidings onthardende temperaturen om toelaten tezelfdertijd worden getest zeer de tijd verminderd die voor deze stap wordt vereist.  Zodra de optimale voorwaarden voor een reactie zijn verkregen, kan de reactie dan eenvoudig worden herhaald (1.7.13.16). 

Gevoeligheid:  PCR kan opeenvolgingen van minieme hoeveelheden doelDNA, zelfs DNA vergroten van single cell (24).  Dergelijke uitstekende gevoeligheid heeft zich nieuwe methodes veroorloofd om moleculaire pathogenese te bestuderen en talrijke toepassingen in gerechtelijke wetenschap, in diagnose gevonden, in genetische aaneenschakelingsanalyse gebruikend enig-sperma het typen en in moleculaire paleontologiestudies, waar de steekproeven minieme aantallen cellen kunnen bevatten. Nochtans, betekent de extreme gevoeligheid van de methode dat de grote zorg om verontreiniging van de steekproef in onderzoek te vermijden door externe DNA moet worden genomen, zoals van minieme hoeveelheden cellen van de exploitant (1.7.13.16).

Robuustheid:  Een brede waaier van nucleic zuurbronnen is geschikte malplaatjes voor PCR versterking.  Gezuiverde DNAs van diverse soorten en de bronnen zijn vergroot.  PCR kan versterking van specifieke opeenvolgingen van materiaal toelaten waarin DNA slecht wordt gedegradeerd of in een middel gedegradeerd waarvan de conventionele isolatie van DNA problematisch is. Dientengevolge, is het opnieuw zeer geschikt voor moleculaire antropologie en paleontologiestudies, bijvoorbeeld de analyse van DNA die van archeologische overblijfselen wordt teruggekregen. Het is ook gebruikt met succes om DNA van formaline-vaste of paraffine-ingebedde weefselsteekproeven te vergroten, die belangrijke toepassingen in moleculaire pathologie en, in sommige gevallen, genetische aaneenschakelingsstudies heeft.  Over het algemeen, is het succes van PCR versterking grootst wanneer de doelfragmenten vrij overvloedig zijn (1.7.13.16). 

Ondanks zijn reusachtige populariteit, heeft PCR bepaalde beperkingen als methode voor selectief het klonen de specifieke opeenvolgingen van DNA. 
om specifieke oligonucleotide inleidingen te construeren die selectieve versterking van een bepaalde opeenvolging toelaten van DNA, is wat vroegere opeenvolgingsinformatie gewoonlijk noodzakelijk.  Dit betekent normaal dat het gebied van DNA van belang gedeeltelijk, vaak na het vroegere op cel-gebaseerde klonen van DNA eerder is gekenmerkt.  Nochtans, zijn een verscheidenheid van benaderingen ontwikkeld die verminderen of zelfs de behoefte aan vroegere de opeenvolgingsinformatie van DNA betreffende doelDNA uitsluiten.  De eerder niet gekenmerkte opeenvolgingen van DNA kunnen soms worden gekloond gebruikend PCR met gedegenereerde oligonucleotides als zij lid van een gen of herhaalde familie minstens één zijn van DNA van van wie leden eerder is gekenmerkt.   In sommige gevallen, kan PCR effectief zonder enige vroegere opeenvolgingsinformatie betreffende doelDNA worden gebruikt om indiscriminateamplification van de opeenvolgingen van DNA uit een bron van DNA toe te laten die in extemely beperkte hoeveelheden aanwezig is.  Daarom hoewel PCR kan worden toegepast om gehele genoomversterking te verzekeren, het niet het voordeel van hetgebaseerde klonen van DNA in het aanbieden van een manier heeft om de individuele klonen van DNA te scheiden bestaand uit een genomic bibliotheek van DNA.
De hoeveelheid PCR product die in één enkele reactie wordt verkregen is ook meer beperkt dan het bedrag dat kan zijn het verkregen op cel-gebaseerd gebruiken klonend waar schaal-op van de volumes van celculturen mogelijk is. De efficiency van een PCR reactie zal van malplaatje aan malplaatje en volgens diverse factoren variëren die worden vereist om de reactie te optimaliseren maar typisch slechts worden de betrekkelijk kleine hoeveelheden product bereikt.
Hoewel de theoretische opbrengst van PCR exponentieel is, is de daadwerkelijke opbrengst van PCR veel minder erop wijzend dat de regeling met minder dan zijn maximumpotentieel werkt.  Bijvoorbeeld, de hoeveelheid product op elke cyclus uiteindelijk niveaus weg.  Dit plateau kan door de volgende fenomenen worden verklaard.  Eerst, kan enkele malplaatje nooit beschikbare toe te schrijven aan bundelonderbrekingen of mislukking van DNA aan gescheiden zijn van andere macromoleculen tijdens reiniging en aanvankelijke thermocycles.  Ten tweede, is de hoeveelheid enzym eindig en uiteindelijk kan de activiteit verminderen.  Ten derde, aangezien de concentratie van het double-stranded product hoge niveaus, de concurrentieverhogingen tussen het ontharden van malplaatje (PCR product) aan inleiding en het reannealing van de bijkomende malplaatjebundels bereikt (1.7.13).
Duidelijk en velen is tijden groot nadeel van PCR als het klonen van DNA methode de groottewaaier van de opeenvolgingen geweest van DNA die kunnen worden gekloond.  In tegenstelling tot op cel-gebaseerde DNA kloont die waar de grootte van de gekloonde opeenvolgingen van DNA 2 Mb kan naderen, zijn de gemelde opeenvolgingen van DNA die door PCR worden gekloond typisch in de 0.1 5kb groottewaaier, vaak op het lagere eind van deze schaal geweest.  De kleine fragmenten van DNA kunnen gewoonlijk gemakkelijk door PCR worden vergroot, nochtans wordt het meer en meer moeilijker om efficiënte versterking te verkrijgen aangezien de gewenste productlengte stijgt.  Barnes (25) erkende een beperking van de doellengte aan PCR versterking van DNA.  Hij gebruikte een combinatie van een hoog niveau van een exonuclease-vrije, n-Eindschrappingsmutant van de polymerase van DNA Taq, Klentaq1, met zeer laag van het thermostable de polymerase van DNA tentoonstellen 3 ' - exonucleaseactiviteit (Pfu, Opening, of Diepe Opening) om hoge trouw lange PCR te leiden. Minstens 35 kb van bacteriofaag lambda kunnen aan hoge opbrengsten van 1 ng van het malplaatje van lambdaDNA worden vergroot.  Het gebruik van deze methode bracht verhoogde basis-paar trouw, de capaciteit om PCR producten als inleidingen te gebruiken, en de maximumopbrengst van doelfragment op.  Andere voorwaarden zijn geïdentificeerdb voor efficiënte versterking van langere doelstellingen, met inbegrip van versterking van zelfs 22 kb van de cluster van het bèta-globingen van menselijke genomic DNA en tot 42 kb van phagalambda DNA (26).  De voorwaarden voor deze lange PCRs omvatten verhoogde pH, toevoeging van glycerol en dimethyl sulfoxide, verminderde denaturatietijden, verhoogde uitbreidingstijden, en het gebruik van een secundaire thermostable polymerase van DNA die een ' - aan 5 ' - exonuclease 3, of „het corrigeren,“ activiteit bezit.  Het „lange PCR“ protocol handhaafde de specificiteit die voor doelstellingen in genomic DNA door lagere niveaus van polymerase en temperatuur en zoute voorwaarden te gebruiken voor het specifieke inleiding ontharden wordt vereist.  De capaciteit zal om de opeenvolgingen van DNA van 10-40 kb te vergroten de snelheid en de eenvoud van PCR brengen aan genomic afbeelding en het rangschikken en zal studies in moleculaire genetica vergemakkelijken (26).  Over het algemeen, impliceren de voorwaarden voor lange waaierPCR een combinatie wijzigingen aan standaardvoorwaarden met een twee-polymerase systeem.  Dit verstrekt optimale niveaus van de polymerase van DNA en 3' aan 5' exonucleaseactiviteit die als het corrigeren mechanisme dient (16).

Thermocyclers wat automatisch temperaturen voor PCR cirkelend regelen werd geïntroduceerdi in 1986 (Figuur 6).  Naast de vooruitgang in PCR reagentia, zijn de nieuwe instrumenten voor het geautomatiseerde thermische cirkelen en voor het analyseren van PCR producten ontwikkeld.  Nieuwe thermische cyclers hebben tarieven om te verwarmen, verhoogd te koelen, en hitteoverdracht tot gewijzigde reactieschepen.  De reactieschepen die door eerste generatie thermische cyclers (of zelfs waterbaden en het verwarmen blokken worden aangepast) waren standaard plastic microfugebuizen.  PCR versterking in dunne haarvaten stond het snelle thermische cirkelen, en de synthese van DNA aan jaren '20 toe.  De snelheid van de temperatuurveranderingen bereikte heeft in deze systemen de nauwkeurige definitie van temperatuuroptima voor elke individuele stap in de PCR cyclus toegestaan.   Nieuwe generatie thermische cyclers passen meer steekproeven aan, hebben ook nauwkeurigere thermische profielen, en zijn programmeerbaar (13). 

Één van de minste gewaardeerde bijdragen tot de wijdverspreide toepassing van PCR is de ontwikkeling van betrouwbare geautomatiseerde chemie voor oligonucleotide synthese geweest.  Tot onlangs, was de bouw van één enkele oligonucleotide een wezenlijke taak die slechts door een deskundige organische chemicus kon worden uitgevoerd.  Nu is het mogelijk om of een oligonucleotide synthesizer te kopen die door een technicus of oligonucleotides zelf uit een commerciële of academische bron kan worden in werking gesteld.  De samengestelde oligonucleotide synthesemachines zijn geconstrueerd met het doel de algemene kosten van synthese (27.28) te drukken.  Aangezien oligonucleotides de uiteindelijke PCR producten bepalen, is er weinig twijfel dat bij gebrek aan hun klaar levering, PCR niet van de brede goedkeuring zou genoten hebben die het vandaag heeft bereikt (13). 

De onderzoekers gingen akkoord vroeg dat het ontwerp van PCR inleidingen moeilijk en onbetrouwbaar was.  De computerprogramma's werden bedacht om met alle ontwerpcriteria rekening te houden.   Één van de eerste programma's die voor inleidingsontwerp was worden geschreven Olga wat van de implementatie van de Digitale GEM van het Onderzoek (de Manager van het Milieu van de Grafiek) op Atari ST gebruik maakte (29).  Olga werd specifiek aangepast voor de polymerasekettingreactie die (PCR) gelijktijdige analyse van twee inleidingsopeenvolgingen toestaat.  Het voordeel van Olga was dat het in één programmaanalyses directe herhalingen voorzag, secundaire structuren en inleidingsdimerization evenals verscheidene nuttige „het eindigen“ hulpmiddelen voor arbeiders belast met PCR optimalisering en oligonucleotide synthesen.   Het Primer3- programma bij het Instituut Whitehead wordt nu verondersteld om het betrouwbaarste en veelzijdige nu verkrijgbare hulpmiddel te zijn (30).

PCRs kan nu toelatend de versterking van de fragmenten van DNA tot verscheidene kilobases in lengte door meer dan één worden uitgevoerd miljoen keer hun aanvankelijke overvloed.  De procedure is hoogst automatable en vereist enkel een paar uren van het beginnen van met het thermocyling aan productanalyse.  Dit was niet eerder het geval, en de praktische vereisten om PCR zijn uit te voeren zeer vereenvoudigd sinds de eerste manuscripten van de methode (13).  Vandaag, zijn de meeste aanvankelijke hitches of de ondoelmatigheden van PCR uitgewerkt (8).   Voorts heeft PCR zich uitgebreid om meer dan 270.000 artikelen (31) te omvatten.

  De kettingreactie van de polymerase is de wijdst gebruikte methode voor versterking de in vitro van DNA nochtans vereist het thermische denaturatie of het thermocycling om de twee bundels van DNA te scheiden.  In vivo, wordt DNA herhaald door de polymerase van DNA met diverse bijkomende proteïnen.   Helicase van DNA, een polymerase bijkomende proteïnen van DNA handelt aan afzonderlijke duplexDNA binnen cellen.  Vincent et al. (32) een nieuwe isothermische de versterkingsmethode in vitro van DNA door het levende replicatiemechanisme na te bootsen hebben bedacht.  De helicase-afhankelijke versterking (HAD) gebruikt een helicase van DNA om single-stranded malplaatjes voor inleidingskruising te produceren.  De verdere inleidingsuitbreiding wordt dan gekatalyseerd door een polymerase van DNA.  HAD vereist geen dure thermocycler en zo kan PCR praktisch overal worden uitgevoerd.  Bovendien biedt het verscheidene voordelen over andere isothermische de versterkingsmethodes van DNA door het hebben van een eenvoudige reactieregeling en het zijn aan een ware isothermische reactie die bij één temperatuur voor het volledige proces kan worden uitgevoerd. HAD aanbiedingen grote belofte in de ontwikkeling van de eenvoudige draagbare kenmerkende apparaten van DNA die op het gebied en bij de punt-van-zorg (32) moeten worden gebruikt.

Het wordt gezegd de eenvoudigste en geschiktste manier om PCR te bepalen is als techniek.  Nochtans, elimineert zulk een categoriseren de geschiedenis van PCR ontwikkeling aangezien vele individuen in de loop van de jaren tot de ideeën achter de theorie van PCR en de verfijning van de techniek bijdroegen.  Het volgende eenvoudigste antwoord is een individu als uitvinder van de polymerasekettingreactie te noemen.  Karry Mullis werd toegekend de Prijs van Nobel voor Chemie in 1993 voor zijn ontdekking van PCR.  Nochtans, wordt deze ontdekking betwist onder vele wetenschappers, die tot het openen van dit raadsel kan bijgedragen hebben.
Men heeft ook gezegd dat PCR niet bestond tot het aan het werk in een experimenteel systeem werd gemaakt.  Daartoe, slechts volstaat de gedachte van een concept niet; een concept moet met succes in praktijk (33) gebracht te zijn.      
Hoewel er twijfel in verband met de uiteindelijke schepper van PCR, en twijfel in verband met de mogelijkheid zijn dat PCR kan op de een of andere manier of ooit worden vervangen, is er weinig twijfel het effect dattot PCR over een korte tijdspanwijdte op de studie van moleculaire biologie en het leven heeft geleid.

Verwijzingen

1.         Arnheim, N; Erlich, H;  De Strategie van de Kettingreactie van de polymerase. JAARLIJKS OVERZICHT VAN BIOCHEMIE, VOLUME 61. XIV+1359P. , 1992. p. 131-156.
2.         Appenzeller T. Democratizing de opeenvolging van DNA., Wetenschap, 1990 brengt 2, 247 (4946) in de war.
3.         Saiki R, K.; Scharf S; Faloona F; Mullis K.B; Horn G.T; Erlich H.A.; Arnheim N., Enzymatische versterking van bèta-globin de genomic opeenvolgingen en analyse van de beperkingsplaats voor diagnose van de bloedarmoede van de sikkelcel, Wetenschap, Dec, 230 van 1985 20 (4732): 1350-4.
4.         Zuidelijk, E.M. (1975) Opsporing van specifieke opeenvolgingen onder de fragmenten van DNA die door gelelektroforese worden gescheiden. J. Mol. Biol. 98:503 - 518.
5.         Mullis K.B; Faloona F. A; Scharf S; Saiki R.K; Hoorn G; Erlich H.A., Specifieke enzymatische versterking van DNA in vitro: de polymerasekettingreactie. De Symposia van ColdSpringHarbor over Kwantitatieve Biologie, 1986
6.         Mullis K.B; F.A. faloona-Specifieke synthese van DNA in vitro via een polymerase-gekatalyseerde kettingreactie. Methodes in Enzymologie, 1987, 155:335 - 50.                
7.         Gibbs, R.A; De Versterking van DNA door de Kettingreactie van de Polymerase.  Analytische Chemie, 1990, 62:1202 - 1214.
8.         Mullis, K.B; De ongebruikelijke Oorsprong van de Kettingreactie van de Polymerase, Wetenschappelijke Amerikaan, April 1990.
9.         Kleppe, KE; Khorana, Hg; (1971) J. Mol. Biol. 56, 341-346.
10.       Keir, H; De polymerase van DNA van zoogdiercellen. Nucleic Zuur Onderzoek Mol Biol. 1965 van Prog; 4: 81-128.
11.       Fansler, BS; Eukaryotic polymerase van DNA: hun vereniging met de kern en verhouding met de replicatie van DNA. Omwenteling Cytol van int. 1974; Supplement 4:363 - 415.
12.       Saiki R.K; Gelfand D.H; Stoffel S; Scharf S.J; Higuchi R; Horn G.T; Mullis K.B; Erlich Ha. Inleiding-geleide enzymatische versterking van DNA met een thermostable polymerase van DNA. Wetenschap, Januari, 239 van 1988 29 (4839): 487-91.
13.       Erlich, H. A; Gelfand, D; Sninsky, J.J. Recent Advances in de Kettingreactie van de Polymerase., Wetenschap, 1991, v.252, n.5013, 1643-1651.
14.       Williams, JF; De strategieën van de optimalisering voor de polymerasekettingreactie. Biotechniques. 1989 juli-Augustus; 7 (7): 762-9.
15.       DY van Wu, Ugozzoli L, Pal BK, Qian J, Rb Wallace.  Het effect van temperatuur en oligonucleotide inleidingslengte op de specificiteit en efficiency van versterking door de polymerasekettingreactie.  April van de Cel Biol. 1991 van DNA; 10 (3): 233-8.
16.       Strachan, T; Lees A.P; Menselijke Moleculaire Genetica 2. 1999. John Wiley & Van Zonen Inc.- Hoofdstuk 6 Sectie 1.
17.       Scharf S.J; Horn G.T; Erlich H.A. het Directe klonen en opeenvolgingsanalyse van enzymatisch vergrote genomic opeenvolgingen. Wetenschap, Sep, 233 van 1986 5 (4768): 1076-8.
18.       Cline J, Braman JC, Hogrefe HH; PCR trouw van de polymerase van pfuDNA en andere thermostable polymerase van DNA.  Nucleic Zuren Onderzoek. 1996 15 Sep; 24 (18): 3546-51.
19.       Falooea, F., Weiss, S., Ferre, F., Mullis, K. 1990 6de Int.Conf. AIDS. Samenvatting.
20.       D' Aquila, R.T., Bechtel, L.J., Videler, J.A, Eron, J.J., Goeczyca, P., Kaplan, J.C. 1991.  Nucleic Zuren Onderzoek. 19:3749.
21.       Dang C, Jayasena BR. Oligonucleotide de inhibitors van de polymerase van DNA Taq vergemakkelijken opsporing van de lage doelstellingen van het exemplaaraantal door PCR. J Mol Biol. 1996 29 Nov.; 264 (2): 268-78.
22.       Kellogg DE, Rybalkin I, Chen S, Mukhamedova N, Vlasik T, Siebert PD, Chenchik A. TaqStart Antibody: „heet begin“ PCR die door een neutraliserend monoclonal antilichaam wordt vergemakkelijkt dat tegen de polymerase van DNA wordt geleid Taq. Biotechniques. 1994 Jun; 16 (6): 1134-7.
23.       Kermekchiev MB, Tzekov A, Barnes WM. De koud-gevoelige mutanten van de polymerase van DNA Taq verstrekken een heet begin voor PCR. Nucleic Zuren Onderzoek. 2003 1 Nov.; 31 (21): 6139-47.
24.       Li van H., U.B. Gyllenstein, X. Cui, R.K. Saiki, H. Ehrlich, en N. Arnheim. (1988). Versterking en analyse van de opeenvolgingen van DNA in enig menselijk sperma en diploïde cellenAard 335:414 - 417.
25.       Barnes WM. ; PCR versterking van zelfs 35 kb DNA met hoge trouw en hoge opbrengst van de malplaatjes van de lambdabacteriofaag. Natl Acad Sc.i van Proc de V.S. 1994 breng 15 in de war; 91 (6): 2216-20.
26.       Cheng S, Fockler C, Barnes WM, Higuchi R. Effective versterking van lange doelstellingen van gekloonde tussenvoegsels en menselijke genomic DNA. Natl Acad Sc.i van Proc de V.S. 1994 Jun 7; 91 (12): 5695-9.
27.       Caruthers MH, Barone ADVERTENTIE, Beaucage SL, Dodds DR., Visser EF, McBride LJ, Matteucci M, Stabinsky Z, Zweempje JY.  Chemische synthese van deoxyoligonucleotides door de phosphoramiditemethode.  Methodes Enzymol. 1987; 154: 287-313.
28.       Beattie KL, Logsdon NJ, Anderson RS, espinosa-Lara JM, maldonado-Rodriguez R, Vorst JD derde. De synthesetechnologie van het gen: recente ontwikkelingen en toekomstige vooruitzichten. Biochemie van Appl van Biotechnol. 1988 Dec; 10 (6): 510-21.
29.       Bruggen CG. Olga--oligonucleotide het programma van het inleidingsontwerp voor Atari ST. Comput Appl Biosci. 1990 April; 6 (2): 124-5.
30.       Rozen S, Skaletsky H. Primer3 op WWW voor algemene gebruikers en voor biologenprogrammeurs. Methodes Mol Biol. 2000; 132: 365-86.
31.       Plaats World Wide Web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed Onderzoek: „PCR“
32.       Vincent M, Xu Y, Kong H. Helicase-dependent de isothermische versterking van DNA. EMBO Rep. 2004 Augustus; 5 (8): 795-800. Van Epub 2004 09 Juli.           
33.       Paul Rabinow. Het maken van PCR, een Verhaal van Biotechnologie, Universiteit van de Pers van Chicago, 1996