De sponsor/adverteert & Link met ons & Contacteer ons & Ongeveer ons & Help ons

Moleculaire Biologie Blog

De recente Posten van het Forum

 

Recombinante EiwitUitdrukking

De Moleculaire Post 2006 van het auteursrecht ©

Wanneer u een gen of een proteïne van belang wilt kenmerken, moet u zijn functie eerst bestuderen. In deze moleculaire era, die is een cDNA van uw gen van belang niet moeilijk verkrijgt.

Om cDNA als proteïne uit te drukken, d.w.z. een recombinante proteïne, kan functionele studies gemakkelijk dan uitvoeren gebruikend de recombinante gezuiverde proteïne.

Zodra u een gezuiverde proteïne hebt kunt u leiden:

• De eiwit-eiwit Experimenten van de Interactie
• De Kinetica van het enzym
• Functionele Studies van de Proteïne
• Structurele Studies - met inbegrip van eiwitkristallisatie, eiwitstructuur en NMR.
• U kunt de proteïne ook gebruiken om antilichamen voor verdere experimenten te maken.

 

Er zijn twee belangrijke systemen voor de uitdrukking van recombinante proteïne. Zodra u uw cDNA gekloond krijgt, moet u besluiten waar u uw proteïne wilt vergroten. Dit zal of een prokaryotic (bacterieel) of eukaryotic (gewoonlijk gist of zoogdiercel) systeem zijn. De keus van uw systeem zal beslissen welke vector u nodig zult hebben om uw cDNA in aangezien te klonen er verschillende promotors die in E.Coli functioneren en anderen zijn die het best met gist of zoogdiersystemen werken.

Zo wat het eiwituitdrukkingssysteem u zal gebruiken?

 Systemen voor EiwitUitdrukking

Prokaryotic EiwitSystemen van de Uitdrukking

Prokaryotic recombinante eiwituitdrukkingssystemen hebben verscheidene voordelen. Deze omvatten gemak van cultuur, en de zeer snelle celgroei die u niet moeten lang wachten eiwit van bacteriële systemen betekent zal te worden zodra u uw cDNA kloont. De uitdrukking kan gemakkelijk in bacteriële eiwituitdrukkingssystemen worden veroorzaakt gebruikend IPTG. Ook, is de reiniging vrij eenvoudig in prokaryotic uitdrukkingssystemen en er is een overvloed commerciële uitrustingen beschikbaar voor recombinante eiwituitdrukking.

Enerzijds, als u uw proteïnen voor functionele of enzymatische studies moet gebruiken prokaryotic systemen een probleem aangezien de meeste proteïnen in opnemingsorganismen onoplosbaar worden zijn en zeer moeilijk om als functionele proteïnen zijn terug te krijgen. Voorts kunnen de meesten als niet alle post-vertalende wijzigingen niet door bacteriën en daarom uw proteïne van belang worden toegevoegd niet functioneel zijn. De enzymatische studies kunnen zo vruchteloos zijn.

Eukaryotic Systemen van de Uitdrukking

Eukaryotic genen zijn niet werkelijk „thuis“ in prokaryotic cellen, zelfs wanneer zij onder de controle van de prokaryotic vectoren worden uitgedrukt.  Één reden is dat de cellen van E. coli vaak de eiwitproducten van gekloonde eukaryotic genen als buitenstaanders zien en hen vernietigen.  Een andere is dat prokaryotes niet de zelfde soorten posttranslationalwijziging uitvoeren zoals eukaryotes.  Bijvoorbeeld, een proteïne die doorgaans aan suikers in een eukaryotic cel zou gekoppeld worden zal als naakte proteïne worden uitgedrukt wanneer gekloond in bacteriën.  Dit kan de activiteit of de stabiliteit van een proteïne, of minstens zijn reactie op antilichamen uitvoeren.  Een ernstiger probleem is dat het binnenland van een bacteriële cel niet zo bevorderlijk is voor het juiste vouwen van eukaryotic proteïnen zoals het binnenland van een eukaryotic cel.  Vaak, is het resultaat incorrect gevouwen, inactieve producten van gekloonde genen. 

Eukaryotic systemen voor de uitdrukking van proteïne omvatten:

• gist
• zoogdier cellen
• baculovirus cellen (insect)

Al deze systemen zijn grote eukaryotic systemen voor de uitdrukking van recombinante proteïnen.
De voordelen van eukaryotic eiwituitdrukkingssystemen omvatten het feit dat u hoge niveaus van uitdrukking kunt zeer worden. De proteïnen zijn gemakkelijk om het gebruiken van speciale markeringen te zuiveren die in de vectoren met inbegrip van van hem, Myc en andere markeringen inbegrepen zijn.

U kunt plasmiden zelfs kopen die uw proteïne in de media afscheiden. Daarom kunt u houden groeiend uw systeem en verzamelend de media zonder uw cellen lysing. Er zijn geen opnemingsorganismen om zich ongerust te maken over en uw proteïnen hebben intacte post-vertalende wijzigingen. Deze zijn essentieel als u de functie van eiwit en/of eiwit-eiwitinteractie bestudeert.

De nadelen van eukaryotic eiwituitdrukkingssystemen omvatten het feit dat eukaryotic cellen langzamer groeien dan prokaryotic cellen.

De Vectoren van de uitdrukking met Sterke Promotors

De belangrijkste functie van een uitdrukkingsvector is het product van een gen op te brengen gewoonlijk, het meer product beter.  Daarom zijn de uitdrukkingsvectoren doorgaans uitgerust met zeer sterke promotors; de reden is dat meer mRNA die wordt geproduceerd, het meer eiwitproduct zal worden gemaakt.
Één dergelijke sterke promotor is de trp (tryptofaan operon) promotor.  Het vormt de basis voor verscheidene uitdrukkingsvectoren, met inbegrip van ptrpL1.  Het heeft een van de trppromotor/exploitant gebied, dat door een plaats van de ribosoomband wordt gevolgd, en kan direct als uitdrukkingsvector worden gebruikt door een buitenlands gen in de plaats op te nemen ClaI. Alternatief, kan het gebied van de trpcontrole „draagbaar worden gemaakt“ door het uit te snijden met ClaI en HindIII en het op te nemen voor een gen dat in een andere vector moet worden uitgedrukt

 

De afleidbare Vectoren van de Uitdrukking

Het is gewoonlijk voordelig om een gekloond gen te houden represed tot wij bereid zijn om het uit te drukken.  Één reden is dat eukaryotic proteïnen die in grote hoeveelheden in bacteriën worden geproduceerd giftig kunnen zijn.  Zelfs als deze proteïnen niet echt giftig zijn, kunnen zij aan auch grote niveaus opbouwen dat zij zich in de bacteriële groei mengen.  In één van beide geval, als het gekloonde gen om constant aangezet werd toegestaan te blijven, zouden de bacteriën die het gen dragen nooit aan een grote genoeg concentratie groeien om zinvolle hoeveelheden van eiwitproduct te veroorzaken.  De oplossing is het gekloonde gen uitgezet te houden door het van een afleidbare promotor stroomafwaarts te plaatsen die kan worden uitgezet.
De lakpromotor is in zekere mate afleidbaar, vermoedelijk weg blijvend tot bevorderd door synthetische inductorisopropylthiogalactoside (IPTG).  Nochtans, is wordt veroorzaakt de onderdrukking die door de lakonderdrukker onvolledig, en wat uitdrukking van het gekloonde gen zal zelfs bij gebrek aan inductor worden waargenomen.  Unidirectioneel rond dit probleem is ons gen in een plasmide uit te drukken of phagemid die zijn eigen lacIgen draagt, aangezien pBS.  De bovenmatige onderdrukker die door zulk een vector wordt geproduceerd houdt ons gekloond gen uitgezet tot wij bereid zijn om het met IPTG te veroorzaken.
Een andere strategie moet een strak gecontroleerde promotor als λ phage promotor PL gebruiken. De vectoren van de uitdrukking met dit promotor/exploitantsysteem worden in gastheercellen gekloond die een temperatuur-gevoelig λ onderdrukkersgen dragen (c1857).  Zolang wij de temperatuur van deze vrij lage cellen (32°C) houden, functioneert de onderdrukker, en geen uitdrukking vindt plaats.  Nochtans, wanneer wij de temperatuur op het nonpermissive niveau (42ºC) opheffen, kan de temperatuur-gevoelige onderdrukker niet meer functioneren en het gekloonde gen wordt veroorzaakt.

 

De Vectoren van de uitdrukking die de Proteïnen van de Fusie produceren

Wanneer de meeste uitdrukkingsvectoren werken, produceren zij fusieproteïnen.  Dit zou eerst een nadeel kunnen schijnen omdat het natuurlijke product van het opgenomen gen niet wordt gemaakt.  Nochtans, kunnen de extra aminozuren op de fusieproteïne een grote hulp zijn in het zuiveren van het eiwitproduct.

Overweeg de vectoren van de oligo-histidineuitdrukking, één waarvan handelsnaampTrcHis heeft.  Deze hebben stroomopwaarts een korte opeenvolging enkel van de veelvoudige het klonen plaats die een rek van zes histidine codeert.  Aldus, zal een proteïne die in zulk een vector wordt uitgedrukt een fusieproteïne met zes histidine op zijn aminoeind zijn.  Waarom zouden wij zes histidine aan onze proteïne willen vastmaken?  De gebieden van het oligo-histidine als dit hebben een hoge affiniteit voor metalen zoals nikkel, zodat kunnen wij proteïnen zuiveren die dergelijke gebieden hebben die de chromatografie van de nikkelaffiniteit gebruiken.  De schoonheid van deze methode is zijn eenvoud en snelheid.  Nadat de bacteriën de fusieproteïne hebben gemaakt, lyse wij hen eenvoudig, toevoegen srude het bacteriële uittreksel aan een kolom van de nikkelaffiniteit, alle unbound proteïnen uitwast, dan versie de fusieproteïne met histidine of een histidineanalogon genoemd imidazole.  Deze procedure staat ons toe om zuivere fusie in slechts één stap hoofdzakelijk te oogsten.  Dit is mogelijk omdat zeer weinig of geen natuurlijke proteïnen oligo-histidinegebieden, zodat onze fusieproteïne hebben hoofdzakelijk enige zijn die aan de kolom bindt.

Wat als wij onze eiwitvrij van de oligo-histidinemarkering willen? 

De ontwerpers van deze vectoren hebben zorgvuldig een manier verstrekt om het te verwijderen.  Vlak vóór de veelvoudige het klonen plaats, is er een codagegebied voor een rek van aminozuren die door proteolytic enzymenterokinase wordt erkend.  Zo kunnen wij enterokinase gebruiken om de fusieproteïne in twee delen te splijten:  de oligo-histidinemarkering en de proteïne die wij hebben gewild. De plaats die door enterokinase wordt erkend is zeer zeldzaam, en de kans dat het in onze proteïne bestaat is onbelangrijk.  Aldus, zou onze proteïne niet omhoog moeten worden gehakt aangezien wij zijn oligo-histidinemarkering verwijderen.  Als wij willen, kunnen wij de enterokinase-gespleten proteïne de nikkelkolom weer eens doornemen om de oligo-hisitidinefragmenten van de proteïne van belang te scheiden.

λ de bacteriofagen hebben ook als basis voor uitdrukkingsvectoren gediend;  ontworpen één specifiek met deze bedoeling is λgt11.  Deze bacteriofaag bevat een gebied van de lakcontrole dat door het lacZgen wordt gevolgd.  De het klonen plaatsen worden gevestigd binnen het lacZgen, zodat zullen de producten van een gen dat in deze vector wordt opgenomen fusieproteïnen met een leider van B-Galactosidase zijn.
De uitdrukking vectorλgt11 is een populair voertuig geworden om te maken en het onderzoeken cDNA bibliotheken.  λgt11 staat ons om een groep klonen voor de uitdrukking van de juiste proteïne toe direct te onderzoeken.  De belangrijkste ingrediënten die voor deze procedure worden vereist zijn cDNA bibliotheek in λgt11 en een antiserum dat tegen de proteïne van belang wordt geleid.
Wij plateren onze bacteriofagen λ met diverse cDNAtussenvoegsels en bevlekken de proteïnen die door elke kloon op een steun zoals nitrocellulose worden vrijgegeven.  Zodra wij de proteïnen van elke plaque aan nitrocellulose hebben overgebracht, sonderen wij met ons antiserum.  Daarna, zoeken wij antilichaam verbindend aan proteïne van een bepaalde plaque, gebruikend geëtiketteerdee eiwitA van goudhoudende Stafylokok.  Deze proteïne bindt strak aan antilichaam en etiketteert de overeenkomstige vlek op het nitrocellulose.  Wij ontdekken dit etiket door autoradiografie of door phosphorimaging, dan gaan naar onze hoofdplaat en plukken de overeenkomstige plaque.  Merk op dat wij een fusieproteïne, niet de proteïne van belang zelf ontdekken.  Voorts is van belang het niet als wij een gehele cDNA of niet hebben gekloond.  Ons antiserum is een mengsel van antilichamen dat met verscheidene verschillende delen van onze proteïne zal reageren, zo zelfs zal een gedeeltelijk gen doen, zolang zijn codagegebied in het zelfde richtlijn en lezingsframe zoals het B-Galactosidase codagegebied wordt gekloond.

Voor een snel recombinant eiwituitdrukkingsoverzicht zie:

Recombinante EiwitSystemen

 

De Moleculaire Post 2006 van het auteursrecht ©