Onthaal aan Moleculaire Post!

U moet registreren alvorens u op onze forums kunt posten of onze geavanceerde eigenschappen gebruiken. Register nu! Zijn Vrij en Snel!

Reeds geregistreerd? Login nu hieronder.

De Naam van de gebruiker:

Wachtwoord:

Herinner me?

Vergat reeds geregistreerd en uw wachtwoord? Klik hieronder om het terug te krijgen.

Krijg Verloren Wachtwoord terug

Treed nu toe - het is snel en vrij!

De moleculaire Post is overal het grootste netwerk van onderzoekers, wetenschappers en wetenschapsminnaars!

De recente Posten van het Forum

Geautomatiseerde Degradatie Edman

De Opeenvolgingen van het aminozuur kunnen door Geautomatiseerde Degradatie worden bepaald Edman

De aminozuursamenstelling van peptide wordt bepaald.  Peptide wordt gehydroliseerd in zijn constituerend aminozuur door het in HCl van 6 N bij 110°C 24 uren te verwarmen.  Stanford Moore en William Stein toonden aan dat de aminozuren in hydrolysates kunnen door ionexchangechromatografie op kolommen van gesulfoneerd polystyreen worden gescheiden en door reagerende hen met ninhydrin worden gekwantificeerd. 

De aminozuren behandelden deze manier geven een intense blauwe kleur, behalve praline, die een gele kleur geeft omdat het een secundaire aminogroep bevat.  De concentratie van aminozuur in een oplossing is evenredig aan de optische absorbering van de oplossing na het verwarmen van het met ninhydrin.  Deze techniek kan een microgram (10nmol) van een aminozuur ontdekken, dat over het bedrag huidig in een thumbprint is. 

Zo weinig zoals een nanogram (pmol 10) van een aminozuur door middel van fluorescamine kan worden ontdekt, die met de a-aminogroep een hoogst fluorescent product reageert.  De identiteit van het aminozuur wordt geopenbaard door zijn elution volume, dat in het volume van buffer dat wordt gebruikt om het aminozuur uit de kolom te verwijderen. 

Het amino-eindresidu van een proteïne of peptide kan worden geïdentificeerd door het met een samenstelling te etiketteren die een stabiele covalente link vormt. 

Fluorodinitrobenzene (FDNB) werd eerst gebruikt met deze bedoeling door Frederick Sanger.  Het chloride van Dabsyl wordt nu algemeen gebruikt omdat het intens gekleurde derivaten vormt die met hoge gevoeligheid kunnen worden ontdekt.  Het reageert met uncharged a-NH2 groep om een sulfonamidenderivaat te vormen dat in de omstandigheden stabiel is die peptide banden hydroliseren. 

Hoewel de dabsylmethode om het amino-eindresidu te bepalen gevoelig en krachtig is, kan het herhaaldelijk op zelfde peptide worden gebruikt niet omdat peptide totaal in de zuur-hydrolysestap wordt gedegradeerd.  Pehr Edman bedacht een methode om het amino-eindresidu te etiketteren en het te splijten van peptide zonder de peptide banden tussen de andere aminozuurresidu's te onderbreken.  De degradatie Edman verwijdert opeenvolgend één residu in een tijd uit het aminoeind van peptide.  Phenyl isothiocyanate reageert met uncharged eind aminogroep peptide om een phenylthiocarbamoylderivaat te vormen.  Dan, in de mildy zuurrijke omstandigheden, wordt een cyclisch derivaat van het eindaminozuur bevrijd, dat intacte peptide die door één aminozuur wordt verkort verlaat.

De analyses van eiwitstructuren zijn duidelijk versneld door de ontwikkeling van sequenators, die geautomatiseerde instrumenten voor de bepaling van aminozuuropeenvolging is.  In een vloeibaar-fasesequenator, wordt een dunne film van proteïne in een spinnende cilindrische kop onderworpen aan de degradatie Edman.  De reagentia en het halen van oplosmiddelen worden overgegaan over de geïmmobiliseerdet film van proteïne, en het vrijgegeven pTH-Aminozuur wordt geïdentificeerd door hoge druk vloeibare chromatografie (ook genoemd krachtige vloeibare chromatografie, HPLC). 

Één cyclus van de degradatie Edman wordt uitgevoerd in minder dan twee uren.  Door herhaalde degradaties, kan de aminozuuropeenvolging van zowat vijftig residu's in een proteïne worden bepaald.  Gas-phase sequenators kunnen picomole hoeveelheden peptides en proteïnen analyseren.  Deze hoge gevoeligheid maakt het haalbaar om de opeenvolging van een eiwitsteekproef te analyseren die van één enkele band van een sDS-Polyacrylamide gel wordt uitgewassen.